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慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML),简称慢粒,是以t(9；22)(q34；q11)形成的BCR/ABL融合基因为发病特征的骨髓增殖性疾病。BCR/ABL融合基因编码的Bcr-Abl融合蛋白具有高酪氨酸激酶活性,在疾病的发生、发展及耐药中发挥着重要的作用。临床治疗慢粒的一线药物伊马替尼(格列卫,Imatinib,IM),通过特异性地抑制Bcr-Abl酪氨酸激酶活性,从而达到治疗疾病的目的。随着临床应用,越来越多的病人出现对IM耐药,尤其是白血病干细胞(Leukemic stem cells,LSCs)的存在加重了慢粒病人对IM的耐药现象。慢粒在临床上分为三期：慢性期,加速期和急变期。从慢性期到急变期的转变是慢粒的致死性进展,其根本原因是由于LSCs的产生与扩增。研究表明,β-catenin作为Wnt信号通路中的关键调控分子,可介导Wnt/β-catenin信号通路进而影响LSCs的生长,增殖与分化,但其对慢粒急变期CD34+细胞的影响及机制尚未完全明确。由于CD34+细胞大量存在于慢粒急变期病人骨髓中,并且前期研究已证实了β-catenin在慢粒急变期细胞(K562细胞,KU812细胞)中具有较高的表达水平。因此,β-catenin可能在慢粒急变期的CD34+细胞中存在高表达。吲哚美辛(IndomethaciN,IN)是一种环氧合酶抑制剂,可通过PGE2信号通路与Wnt信号通路相互作用,影响β-catenin的表达。因此,本课题采用IN,此种临床上常用的非甾体抗炎药来抑制β-catenin的表达,并联合IM,以达到抑制慢粒急变期病人CD34+细胞增殖及促凋亡的作用。本研究首先收集了临床慢粒慢性期、急变期病人骨髓标本和正常产妇脐血标本,免疫磁珠分选出CD34+细胞,检测β-catenin及Bcr-Abl的表达和定位情况。利用IN抑制β-catenin表达,并联合IM,观察其对CD34+细胞增殖、自我更新和凋亡的影响,并初步探讨了其可能的分子机制。主要方法如下：1.采用免疫磁珠分选技术分选慢粒慢性期、急变期病人和正常的产妇脐血标本中的CD34+细胞,流式细胞术鉴定其分选纯度,瑞氏染色观察其细胞形态。并采用流式细胞术、定量PCR和免疫荧光技术检测CD34+细胞中β-cateninaBcr-Abl的表达及定位。2.使用IN抑制CD34+细胞中β-catenin的表达,并联合IM共同处-CD34+细胞,采用MTT检测细胞生长情况；克隆形成实验检测克隆形成能力；流式细胞术检测细胞周期；瑞氏染色和流式细胞术检测细胞凋亡；定量PCR技术检钡c-myc和cyclinD1的转录水平。研究结果如下：1.免疫磁珠分选技术成功分选出慢粒慢性期、急变期病人骨髓标本和正常产妇脐血标本中CD34+细胞；流式细胞术鉴定其分选纯度可达90%以上；瑞氏染色结果显示三种标本中的CD34+细胞形态无明显差异；定量PCR、流式细胞术和免疫荧光技术表明,β-catenin和Bcr-Abl均在慢粒急变期CD34+细胞表达最高,且主要定位于胞浆中。2. IN能够显著抑制慢粒急变期CD34+细胞中β-caten in的表达。MTT和克隆形成实验均显示IN可抑制细胞增殖和克隆形成能力；流式细胞术结果证实,单独使用IN不引起细胞周期的改变和凋亡,与IM联用可使细胞周期被阻滞在G0/G1期,并且加强IM对细胞的促凋亡作用,；定量PCR结果表明吲哚美辛可抑制β-catenin下游靶基因c-myc和cyclinD1的转录,并且在联合用药组表现的更加明显。综上所述,β-catenin和Bcr-Abl在慢粒急变期CD34+细胞均为高表达。IN抑制β-catenin后,CD34+细胞增殖和自我更新能力受到抑制,并通过与IM联用增强IM的杀伤力,其机制可能与Wnt/β-catenin信号通路相关。