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一、背景与目的肩袖损伤修复后只能以瘢痕连接愈合,难以恢复原本的纤维软骨性骨肌腱结合部（BTJ）,有损其机械强度和最大载荷,再损伤率高。BTJ位于肌腱末端的乏血管区,这一部位损伤后的愈合也主要由成纤维细胞参与导致瘢痕愈合,而形成纤维软骨性BTJ需要有多向分化潜能的种子细胞,尤其是能够向肌腱与纤维软骨分化的干细胞。有研究者使用过表达Scx的间充质干细胞在肩袖损伤模型中应用促进了BTJ的修复效果。Scx基因是公认的肌腱特异性标志之一,其表达对肌腱的发育、分化有着至关重要的作用。Scx在间充质干细胞中过表达能调控细胞分化,但Scx调控间充质干细胞分化的机制尚不清楚。我们设计本研究旨在探讨Scx调控间充质干细胞增殖和分化的作用机制。我们通过在大鼠骨髓间充质干细胞中过表达Scx后观察Scx在间充质干细胞中的功能作用。并进一步对其促进促进干细胞增殖和分化具体机制进行探讨,为促进肩袖损伤治疗以及肩修损伤患者术后康复提供理论依据和潜在的治疗方向。二、研究方法（一）大鼠骨髓间充质干细胞的培养原代大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）来自于4周龄的SD大鼠,处死大鼠后取出胫骨、股骨,70%酒精消毒,取出骨髓经过离心、重悬、过滤、洗涤收集骨髓细胞,在完全培养基中培养,将贴壁的单克隆骨髓间充质干细胞培养,获得原代细胞,1:3比例传代。（二）慢病毒构建及细胞转染使用经典方法完成慢病毒载体的构建、扩增和滴度测定,通过慢病毒将Scx转染进入,采用qRT-PCR和Western blot方法检测转染效果。（三）蛋白免疫印迹（Western blot）采用Western blot检测Lv-Scx转染后BMSC中Flag标签蛋白和GAPDH的蛋白表达水平,确定转染效果。细胞样品使用SDS-PAGE裂解提取蛋白,根据目标蛋白的分子量选用分离胶。电泳,湿转法转膜,封闭后孵育一抗、TBST洗涤,孵育二抗,洗膜后显色。采用天能4200全自动化学发光成像分析系统检测分析蛋白条带。（四）实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）试剂抽提大鼠BMSC中总RNA并使用合成的引物反转录成DNA,各样品的目的基因和内参基因分别进行SYBR Green Mix标准方法的qPCR反应,采用2-ΔΔCт计算相对表达量。（五）细胞形态和克隆形成能力变化检测将转染Lv-Scx后的大鼠BMSC经过2次传代后接种在聚苯乙烯玻片上,培养24h后用正相显微镜观察细胞形态学差异;将细胞以10个细胞/cm2的密度接种在10 cm培养皿中,12天后用0.5%结晶紫/甲醇染色显现形成的集落,观察克隆形成能力变化。（六）细胞增殖能力检测（CCK8）转染后的细胞收集、铺板,细胞培养0、24、48、72、96h后加CCK-8处理,酶标仪检测450nm OD值。（七）细胞成骨、成脂肪、成软骨分化能力检测将BMSC-Scx和BMSC-GFP分别进行向成骨细胞、成脂肪细胞、成软骨细胞定向诱导分化,分化后分别进行茜素红、油红O、阿利新蓝染色,观察其三系分化能力。（八）RNA高通量测序技术提取细胞样本总RNA后进行质检,质检合格后反转录扩增建库,构建好的文库用Illumina HiSeq 2500进行测序,测序策略为PE150。（九）细胞免疫荧光染色转染慢病毒后的大鼠BMSC接种于24孔培养板爬片后,经过固定、清洗、封闭、孵育一抗、孵育二抗、染核,封片,放置于荧光显微镜下观察拍照。（十）统计学分析计量资料以平均数±标准差表示,每组的实验数据重复至少3次。采用SPSS 18.0软件进行统计分析,两组间比较采用两独立样本的t检验。以P<0.05作为显著性差异标准。三、结果（一）转录因子Scx抑制BMSC增殖能力在大鼠BMSC中过表达Scx后与对照组相比Scx mRNA表达量提高了约16倍（n=3,P<0.01）,Western blot示Flag标签蛋白表达量显著增加。通过CCK8检测显示过表达Scx后,BMSC的增长速率明显降低;与对照组相比,过表达Scx的BMSC克隆形成能力显著下降。显微镜观察细胞形态学上显示BMSC-Scx细胞逐渐变为梭形,而对照组仍为多角形。（二）转录因子Scx促进了BMSC向腱系细胞分化能力采用qRT-PCR检测过表达Scx后BSMCs中腱系相关基因的表达情况,结果显示与对照组相比,Scx促进了大鼠BMSC中部分腱系基因的表达,结果显示与对照组相比,Scx促进了大鼠BMSC中部分腱系基因的表达,结果显示Col1a1的表达量均提高了约6倍左右（n=3,P<0.05）,Tnmd、Dcn的表达同样上调,而Tnc的表达则出现下调,Fmod、Bgn的变化没有统计学差异。Col1a1和Tnmd的免疫荧光结果进一步证实上述结果。通过三系分化结果对其多能性进行检测,显示BMSC-Scx与BMSC-GFP对比细胞向软骨细胞分化能力显著下降、细胞向脂肪细胞分化能力显著下降、向成骨细胞分化能力无显著差异。qRT-PCR进一步分析结果显示在BMSC-Scx中软骨形成关键基因Sox9表达明显受抑制,与对照组相比软骨分化基因Sox9的表达量下降约67%（n=3,P<0.01）,骨系分化基因Runx2和脂肪系分化基因Taz表达变化无明显统计学差异。（三）转录因子Scx调控间充质干细胞增殖、分化的分子机制我们采用RNA高通量测序探索Scx可能调控BMSC增殖和分化的基因,测序结果显示表达上调基因中有意义的有174个,下调的基因有167个,筛选可能与增殖相关基因Igf1、Hgf和分化相关的基因Rasgrp4、Lgals3、Etv1、Cd36、Bglap、Apold1进行qRT-PCR验证,结果提示:Scx促进了大鼠BMSC中Murc的表达,抑制了CD36、Igf-1的表达,差异具有统计学意义（P<0.01,n=3）。四、结论（一）转录因子Scx能降低间充质干细胞等增殖能力。（二）转录因子Scx通过提高腱系基因的表达从而间充质干细胞向肌腱细胞分化发育,并降低间充质干细胞的多能性。（三）Scx抑制了细胞增殖调控基因Igf1和脂肪分化基因CD36的表达,提高了肌细胞分化调控基因Murc的表达。