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[目的]在中国,肺癌是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,而云南宣威地区是中国肺癌发病率和死亡率最高的地区之一。宣威肺癌预后差、死亡率高,2011年至2013年,男性与女性死亡率分别为116.35/10万和92.00/10万,肺癌占恶性肿瘤死亡构成比的63.03%。目前宣威肺癌的发病机制仍不清楚,阐明宣威肺癌的发病机制,以及筛查宣威肺癌有效诊疗的标志物对于改善宣威肺癌患者的预后意义重大。DNA甲基化是表观遗传学的一项重要内容。研究显示,DNA甲基化与肿瘤的发生发展相关,异常的DNA甲基化在肿瘤形成的早期就可发生,且通过甲基化转移酶抑制剂治疗可以逆转异常的高甲基化,这为肿瘤的早期诊断和靶向治疗提供了新的契机。高通量检测技术如DNA甲基化免疫沉淀联合芯片的检测技术以及精确位点的检测技术如测序、质谱技术的发展为了解全基因组异常甲基化的分布及特定位点的甲基化程度提供了新的研究平台。[方法]1.DNA甲基化标志物的筛选：对10例宣威肺癌组织及配对癌旁肺组织分别采用DNA甲基化免疫沉淀联合芯片(methylated DNA immunoprecipitation combined with microarray analysis, MeDIP)和基因表达谱芯片进行差异甲基化序列(differentially methylated regions, DMRs)和差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)的筛查。将DMRs和DEGs进行联合分析,并进一步通过基因功能注释(The gene ontology, GO)、pathway等生物信息学分析,最终筛选出在宣威肺癌相对于癌旁肺组织高甲基化、低表达、可能与肿瘤相关的候选基因。2.候选基因中差异甲基化序列DNA甲基化程度和表达情况的验证：扩大样本量,在45对宣威肺癌癌组织和癌旁肺组织中通过甲基化敏感高分辨率熔解曲线(methylation-sensitive high-resolution melting, MS-HRM)技术验证芯片筛选出的差异甲基化序列的甲基化状态。在36对宣威肺癌癌组织和癌旁肺组织中通过甲基化质谱检测技术精确检测差异甲基化序列中各个CpG (cytosine-guanine, CpG)单元的甲基化水平。应用实时荧光定量PCR (Real-time fluorescent quantitative PCR, RT-qPCR)和western blot技术在宣威肺癌病例(n=39,n=35)中验证候选基因的表达水平。3.在宣威肺癌中候选基因差异甲基化序列各个CpG单元的甲基化状态或候选基因的表达水平与临床资料的相关分析：采用SPSS22.0统计软件就在宣威肺癌中候选基因差异甲基化序列中各个CpG单元的甲基化状态或相应基因的表达水平与临床资料的相关分析,并作生存曲线分析。[结果]1. MeDIP-chip从宣威肺癌中检测出21432个差异甲基化序列,定义高低甲基化的log ratio值后,筛选出5788个高甲基化序列和1111个低甲基化序列,64.5%(4452/6899)的差异甲基化序列位于启动子区,位于启动子区的序列主要分布在1号、11号、16号、17号、19号染色体上。最终,筛选出了位于启动子区、CpG岛(CpG islands, CGIs)、相应基因低表达并可能与肿瘤相关的58个高甲基化序列及38个对应的基因,就我们的检索范围而言,其中大部分基因在肺癌中未被报道过。在本研究中,我们选择了4个甲基化程度较高、相应基因表达较低、距转录起始点较近的高甲基化序列作为进一步研究的候选差异甲基化序列,对应的基因分别是STXBP6, BCL6B, FZD10和HSPB6。2.4个候选差异甲基化序列的甲基化状态及对应基因表达情况的验证结果：首先,45例宣威肺癌病例的MS-HRM检测结果显示这4个候选序列在宣威肺癌组织中发生高甲基化的比例均显著高于癌旁肺组织(STXBP6:55.6% vs.20%, BCL6B:68.9% vs.40%, FZD10:93.3% vs.77.8%, HSPB6:91.1% vs.68.9%),差异均具有统计学意义(P<0.05),质谱检测结果同样显示STXBP6、BCL6B、FZDIO和HSPB6所检测片段中各个CpG单元在宣威肺癌组织中的甲基化水平均显著高于癌旁肺组织,差异均具有统计学意义(P<0.05)。其次,我们采用RT-qPCR对候选基因在mRNA水平的表达情况进行检测,结果显示与癌旁肺组织相比,STXBP6、BCL6B、FZD10和HSPB6在大部分宣威肺癌组织中的表达均明显下调(>66%),差异均具有统计学意义(P<0.001)。最后,western blot结果显示STXBP6、BCL6B、FZD10及HSPB6蛋白层面的表达在宣威肺癌组织中均明显低于癌旁组织,且表达下调的样本比例比mRNA层面更高(>88.57%),差异均具有统计学意义(P<0.001)。3.临床资料相关性分析显示：STXBP6所检测片段中的CPG20和CPG21单元在Ⅲ期宣威肺癌组织中的甲基化程度较Ⅰ期和Ⅱ期高(P=0.013,P=0.033); FZDIO所检测片段中的CPG1和CPG38单元在Ⅰ期宣威肺癌组织中的甲基化程度较Ⅱ期和Ⅲ期高(P=0.049,P=0.042); BCL6B所检测片段中的CPG9单元的甲基化程度在有淋巴结转移的宣威肺癌组中明显高于无淋巴结转移的宣威肺癌组(P=0.035); STXBP6, BCL6B, FZDIO和HSPB6的mRNA表达水平在<45岁患者组是下调(P<0.05)。未观察到其余各项临床资料(包括临床分期、肿瘤大小、性别、是否吸烟、淋巴结是否转移)与候选基因mRNA的表达水平存在相关性。[结论]本研究中检测出的差异甲基化序列和差异表达的基因为探讨宣威肺癌的发病机理和寻找宣威肺癌诊疗标志物提供了重要依据。STXBP6、BCL6B、FZD10和HSPB6可能是用于宣威肺癌诊疗和判断预后的潜在甲基化标志物。