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研究背景骨,是肿瘤常见的转移部位,在全身转移性肿瘤中列第3位,仅次于肺转移和肝转移。常见的易发生转移的肿瘤有前列腺癌、乳腺癌、肺癌、肾癌、甲状腺癌等。一旦发生肿瘤骨转移,病人的生存率明显降低,并且其生活质量也明显下降。临床上现有的治疗方法,不能有效的预防和减轻肿瘤的骨损害。转移到骨组织的肿瘤细胞,或者原发性骨肿瘤细胞,与骨微环境相互作用,结果是肿瘤生长得到促进,同时导致融骨性骨损伤。肿瘤细胞与骨微环境之间存在双向促进作用,相互作用后的癌细胞和骨相关细胞表达大量趋化因子、黏附分子、细胞生长因子等,其中就包括单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1),以及破骨细胞诱导因子(RANKL)等,这些因子在骨肿瘤相关的骨质损害中发挥重要作用。骨肿瘤通过对骨骼的重塑,从而造成对骨骼的损害,这当中包括成骨和溶骨两种损害机制,临床上以溶骨性损害为主。在临床中不论是转移性骨肿瘤,还是恶性原发性骨肿瘤,或者良性骨肿瘤,都会出现对骨骼的损害,其骨侵袭能力一般与肿瘤的恶性程度相关。单核巨噬细胞在骨侵袭位点聚集,并分泌大量细胞因子,被认为在骨骼重塑过程中起到重要的调节作用。在单核巨噬细胞聚集的过程中MCP-1起到了非常重要的趋化作用。骨骼重塑的过程中,破骨细胞无疑起着非常关键的作用,而MCP-1对于破骨细胞的活化有很强的促进作用。正常骨组织中通常没有MCP-1的表达,在骨骼相关的炎症反应中可见MCP-1呈现非持续性上调。在肿瘤组织中,特别是恶性肿瘤中,MCP-1呈持续性高表达。第一部分单核细胞趋化蛋白-1在恶性骨肿瘤中高表达目的:本研究采用骨肿瘤病人手术切除标本组织,通过检测标本中MCP-1的基因和蛋白表达情况,探讨MCP-1在人转移性骨肿瘤、恶性原发性骨肿瘤、良性骨肿瘤组织中的差异性表达及其意义。方法:收集第三军医大学新桥医院2008年12月-2010年9月手术的骨肿瘤标本共45例。根据肿瘤性质分为3组,转移性骨肿瘤、恶性原发性骨肿瘤、良性骨肿瘤各15例,其中男21例,女24例,平均年龄62岁。应用半定量RT-PCR检测MCP-1 mRNA的表达情况;应用免疫组织化学SP法检测MCP-1的蛋白表达。IPP(Image-Pro Plus)软件分析标本中免疫组化阳性细胞的累积光密度值和阳性表达面积。应用SPSS 13.0软件作统计学处理。P<0.05为差异具有统计学意义。结果:转移性骨肿瘤组MCP-1 mRNA相对表达量(0.862±0.042)高于恶性原发组(0.612±0.051)和良性组(0.171±0.021)(P<0.05)。转移性骨肿瘤组织中MCP-1免疫组化累积光密度(4532.12±190.02)和阳性面积(513.32±89.08μm2)均高于原发性恶性骨肿瘤组(2592.11±120.21)、(308.34±79.33μm2)和良性骨肿瘤组(551.22±79.12)、(115.91±32.68μm2),且其在原发恶性组中的表达水平也高于良性组(P<0.05)。结论:MCP-1在人恶性骨肿瘤中呈高表达,在转移性骨肿瘤表达更显著。MCP-1可能通过介导肿瘤炎性反应增强骨肿瘤的侵袭力。第二部分MCP-1促进肺癌骨转移相关的溶骨性损害的初步研究目的:成骨细胞和肿瘤细胞都具有分泌MCP-1的能力,而且有的肿瘤细胞具有刺激成骨细胞分泌MCP-1的作用。肺癌是发病率最高的癌症,重庆是全国肺癌发病率最高的城市,发生肺癌骨转移的病人很常见。因此,本研究拟采用人外周血作为破骨细胞前体细胞的来源,建立人破骨细胞诱导分化模型;使用95-D人高转移性肺癌细胞株作为研究对象,检测95-D细胞株培养上清中分泌的MCP-1对外周血源性破骨细胞诱导分化的作用。以及检测95-D细胞株是否对成骨细胞诱导破骨分化有促进作用。方法:梯度离心法分离人外周血细胞,得到人单核细胞,作为破骨细胞的前体细胞。使用外源性RANKL和M-CSF诱导破骨细胞定向分化,并使用TRAP染色鉴定其分化效果,对多核TRAP阳性细胞进行计数,并使用骨侵袭实验评估其骨侵袭能力。使用ELISA检测成骨细胞株的培养上清、95-D细胞培养上清中MCP-1的含量。使用人胚胎成骨细胞株hFOB1.19与外周血源性破骨前体细胞共培养,使之定向分化为破骨细胞并鉴定。使用95-D细胞培养的上清,作用于共培养破骨细胞诱导分化模型,并观察其对破骨细胞分化的影响。使用MCP-1特异性受体拮抗剂阻断其效应,观察破骨细胞诱导分化所受到的影响。结果:使用RANKL和M-CSF诱导人外周血可以稳定获得TRAP染色阳性的多核细胞,并且具有骨侵袭能力。hFOB1.19和95-D细胞培养上清中MCP-1含量分别为:402pg/ml、101pg/ml。使用成骨细胞与破骨前体细胞共培养,可以在不加入外源性诱导剂的情况下诱导人外周血源性单核细胞定向分化为破骨细胞。人高转移性肺癌细胞株95-D的细胞培养上清可诱导破骨细胞分化成熟。人高转移性肺癌细胞株95-D的细胞培养上清可增强成骨细胞株hFOB 1.19对破骨细胞诱导分化的作用。使用MCP-1特异性受体CCR2的拮抗剂,可以不同程度的抑制上述几个诱导模型中破骨的分化成熟,减少破骨细胞的骨侵袭能力。结论:MCP-1在破骨细胞诱导分化过程中起促进作用;MCP-1特异性受体CCR2拮抗剂可以部分抑制其对破骨细胞的诱导分化作用。hFOB可以通过分泌MCP-1诱导破骨细胞分化和成熟;95-D可以通过分泌MCP-1诱导破骨细胞分化成熟。95-D可以刺激hFOB分泌MCP-1,从而增强对破骨细胞的诱导分化作用。MCP-1可能是肺癌95-D细胞引起肿瘤相关性溶骨损害的关键途径之一。