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中枢神经系统的大脑皮层是生物体高级神经功能(记忆、感知、思维和语言活动)的物质基础，投射神经元作为功能单位，其发育过程受到精密调控，但相关机制并不清楚。大脑皮层发育异常会导致多种神经精神疾病，如痴呆、自闭症和精神分裂症等。近年来的研究发现长链非编码RNA(lncRNA)在多种关键生物学过程中发挥作用，如胚胎干细胞的干性维持与分化，器官发育及多种疾病的发生等。由于lncRNA能与包括蛋白质、DNA和RNA在内的大分子发生相互作用，故能调控转录、印记、染色质修饰、细胞核转运和细胞信号转导等关键生命过程。但对于lncRNA在大脑皮层神经元发生的功能和作用机制了解甚少。
通过高通量RNA测序技术和生物信息学手段，我们在小鼠大脑皮层中鉴定了一批与蛋白编码基因邻近但反向转录的长链非编码RNA(divergent lncRNA)。其中长链非编码RNAKancr及其邻近蛋白编码基因Kdm2b的长转录产物在小鼠神经元发生高峰期表达。KDM2B是重要的表观遗传调控分子，影响发育、生理和疾病等多种生物学过程。有病例报告显示部分综合性智力障碍的病人中存在Kdm2b缺失突变。组织原位杂交和报告基因小鼠显示Kdm2b的长转录本Kdm2b-LF在新生的神经元和部分中间前体细胞中高表达，但在成熟神经元分布的皮层板低表达，提示其可能参大脑皮层神经元发生过程。Kdm2b-LF的谱系追踪实验显示，Kdm2b-LF标记的细胞谱系主要生成浅层投射神经元。
通过生物信息学和生化实验发现，Kancr是一个在哺乳动物中基因组位置和序列相对保守的长链非编码RNA。组织原位杂交显示Kancr与Kdm2b-LF具有相似的表达模式，提示Kancr可能调控Kdm2b-LF。为了验证该假说，首先在小鼠原代神经前体细胞中进行核质分离实验，实验表明约五分之一的Kancr在细胞核中定位。在小鼠原代神经前体细胞和小鼠神经母细胞瘤细胞系Neuro-2a中敲低Kancr导致Kdm2b-LF的mRNA水平下调。Nuclearrun-on实验进一步发现，敲低Kancr下调了Kdm2b-LF新生RNA的转录水平，但不影响短转录产物Kdm2b-SF的新生RNA，提示Kancr以顺式的方式激活Kdm2b-LF的转录。ChIP和染色质构象捕获技术实验进一步发现，Kancr一方面维持了Kdm2b-LF启动子的染色质激活状态；另一方面通过促进位于Kancr第二个内含子中的顺式激活元件T5与Kdm2b-LF启动子的相互作用，改变T5和Kdm2b-LF启动子的相对方向，创造有利于Kdm2b-LF转录的染色质构型。这两方面的作用激活和维持Kdm2b-LF的转录。而且体内实验表明，包含顺式元件T5的Kdm2b-LF和Kancr启动子在体内能部分驱动内源Kdm2b-LF和Kancr在发育中大脑皮层表达的特异性。随后小鼠子宫内电穿孔实验进一步确认了Kancr对Kdm2b-LF的调控，敲低Kancr，小鼠胚胎表现出神经前体细胞的自我更新能力增强以及投射神经元的迁移受抑制，此表型与敲低Kdm2b-LF相似，且敲低Kancr导致的表型可以通过过量表达KDM2B-LF得到回复。
体内过量表达KDM2B-LF会导致皮层神经前体细胞的自我更新能力减弱，而促进投射神经元的迁移，而敲低Kdm2b的效果与之相反，神经前体细胞的自我更新能力增强，投射神经元的迁移受到抑制。回复实验表明，Kdm2b-LF和短的转录本Kdm2b-SF在神经元发生过程中发挥相似和冗余的功能。Kdm2b-LF是一个多结构域的表观遗传因子，为了阐明其发挥促进投射神经元分化的分子机制，我们构建了一系列Kdm2b-LF各结构域突变或缺失的表达载体，应用小鼠子宫内电穿孔发现，敲低Kdm2b导致的表型可以通过过量表达KDM2B-LF-mJmjC、KDM2B-LF-ΔCXXC、KDM2B-LF-mPHD或KDM2B-LF-ΔFbox突变体得到回复，但不能通过过量表达KDM2B-LF-ΔLRR突变体所回复，这表明KDM2B-LF促进神经元发生的功能依赖于LRR结构域。而且过量表达KDM2B-LF-ΔLRR表现出负显性。虽然KDM2B可通过LRR结构域组装形成非典型的Polycomb抑制复合物PRC1.1，但体内实验表明过量表达复合物PRC1核心成分功能缺失的突变体RING1B(I53A)并没有表现出与过量表达KDM2B-LF-ΔLRR突变体相似的表型，这一结果提示在神经元发生过程中，KDM2B-LF通过LRR结构域发挥作用，但该功能与Polycomb抑制复合物PRC1无关。
在本论文中，我们鉴定了长非编码RNAKancr及其靶基因Kdm2b-LF在小鼠胚胎大脑皮层中的表达模式，并对它们在小鼠皮层神经元发生过程中的生物学功能进行了研究，阐释了长非编码RNAKancr调控Kdm2b-LF的分子机制。我们的工作为探索大脑皮层发育和相关神经系统疾病的靶向治疗提供了理论依据。
通过高通量RNA测序技术和生物信息学手段，我们在小鼠大脑皮层中鉴定了一批与蛋白编码基因邻近但反向转录的长链非编码RNA(divergent lncRNA)。其中长链非编码RNAKancr及其邻近蛋白编码基因Kdm2b的长转录产物在小鼠神经元发生高峰期表达。KDM2B是重要的表观遗传调控分子，影响发育、生理和疾病等多种生物学过程。有病例报告显示部分综合性智力障碍的病人中存在Kdm2b缺失突变。组织原位杂交和报告基因小鼠显示Kdm2b的长转录本Kdm2b-LF在新生的神经元和部分中间前体细胞中高表达，但在成熟神经元分布的皮层板低表达，提示其可能参大脑皮层神经元发生过程。Kdm2b-LF的谱系追踪实验显示，Kdm2b-LF标记的细胞谱系主要生成浅层投射神经元。
通过生物信息学和生化实验发现，Kancr是一个在哺乳动物中基因组位置和序列相对保守的长链非编码RNA。组织原位杂交显示Kancr与Kdm2b-LF具有相似的表达模式，提示Kancr可能调控Kdm2b-LF。为了验证该假说，首先在小鼠原代神经前体细胞中进行核质分离实验，实验表明约五分之一的Kancr在细胞核中定位。在小鼠原代神经前体细胞和小鼠神经母细胞瘤细胞系Neuro-2a中敲低Kancr导致Kdm2b-LF的mRNA水平下调。Nuclearrun-on实验进一步发现，敲低Kancr下调了Kdm2b-LF新生RNA的转录水平，但不影响短转录产物Kdm2b-SF的新生RNA，提示Kancr以顺式的方式激活Kdm2b-LF的转录。ChIP和染色质构象捕获技术实验进一步发现，Kancr一方面维持了Kdm2b-LF启动子的染色质激活状态；另一方面通过促进位于Kancr第二个内含子中的顺式激活元件T5与Kdm2b-LF启动子的相互作用，改变T5和Kdm2b-LF启动子的相对方向，创造有利于Kdm2b-LF转录的染色质构型。这两方面的作用激活和维持Kdm2b-LF的转录。而且体内实验表明，包含顺式元件T5的Kdm2b-LF和Kancr启动子在体内能部分驱动内源Kdm2b-LF和Kancr在发育中大脑皮层表达的特异性。随后小鼠子宫内电穿孔实验进一步确认了Kancr对Kdm2b-LF的调控，敲低Kancr，小鼠胚胎表现出神经前体细胞的自我更新能力增强以及投射神经元的迁移受抑制，此表型与敲低Kdm2b-LF相似，且敲低Kancr导致的表型可以通过过量表达KDM2B-LF得到回复。
体内过量表达KDM2B-LF会导致皮层神经前体细胞的自我更新能力减弱，而促进投射神经元的迁移，而敲低Kdm2b的效果与之相反，神经前体细胞的自我更新能力增强，投射神经元的迁移受到抑制。回复实验表明，Kdm2b-LF和短的转录本Kdm2b-SF在神经元发生过程中发挥相似和冗余的功能。Kdm2b-LF是一个多结构域的表观遗传因子，为了阐明其发挥促进投射神经元分化的分子机制，我们构建了一系列Kdm2b-LF各结构域突变或缺失的表达载体，应用小鼠子宫内电穿孔发现，敲低Kdm2b导致的表型可以通过过量表达KDM2B-LF-mJmjC、KDM2B-LF-ΔCXXC、KDM2B-LF-mPHD或KDM2B-LF-ΔFbox突变体得到回复，但不能通过过量表达KDM2B-LF-ΔLRR突变体所回复，这表明KDM2B-LF促进神经元发生的功能依赖于LRR结构域。而且过量表达KDM2B-LF-ΔLRR表现出负显性。虽然KDM2B可通过LRR结构域组装形成非典型的Polycomb抑制复合物PRC1.1，但体内实验表明过量表达复合物PRC1核心成分功能缺失的突变体RING1B(I53A)并没有表现出与过量表达KDM2B-LF-ΔLRR突变体相似的表型，这一结果提示在神经元发生过程中，KDM2B-LF通过LRR结构域发挥作用，但该功能与Polycomb抑制复合物PRC1无关。
在本论文中，我们鉴定了长非编码RNAKancr及其靶基因Kdm2b-LF在小鼠胚胎大脑皮层中的表达模式，并对它们在小鼠皮层神经元发生过程中的生物学功能进行了研究，阐释了长非编码RNAKancr调控Kdm2b-LF的分子机制。我们的工作为探索大脑皮层发育和相关神经系统疾病的靶向治疗提供了理论依据。