红树植物是位于热带、亚热带海陆交错地带的高等木本植物,它以乔木或者灌木形式构成了维护海岸生态系统的重要植物群落。其最大特点就是可以耐受海水的高盐度（500mM NaCl）。在长期的进化过程中,红树植物形成了特殊的耐盐机制。例如,盐腺、叶的肉质化及通过根的超滤作用来拒绝过度吸收和运输盐分。揭示代表性红树的抗盐性机理,将对经济型林木的抗盐育种具有重要的指导意义。因此,近年来,关于红树耐盐机制的研究已经越来越受到人们的关注,并在抗盐性的生理生化和分子生物学机制等方面取得了一些进展,然而在离子吸收转运的细胞学机制、盐诱导的氧化胁迫与红树耐盐性方面缺乏深入的研究。由于国内外学者对于泌盐型红树的耐盐性存有争议,我们就以两种典型的非泌盐红树秋茄[Kandelia candel （L.）Druce]和木榄[Bruguiera gymnorhiza （L.）Savigny]为材料,重点研究了这两种红树在盐胁迫下的离子平衡和活性氧平衡的调控机制及其与耐盐性的关系:在离子平衡的调控方面,分析了NaCl胁迫下根、茎、叶、胚轴及质外体中的离子关系,特别是Na⁺, Cl^-和K⁺在两种红树叶细胞的离子区隔化,并利用非损伤离子选择微电极技术和X-射线微区分析研究了红树组织和细胞对盐离子的吸收转运过程,并从离子动态转运的角度揭示了两种红树耐盐机制及其差异;在活性氧的调控方面,系统研究了NaCl胁迫下根、叶和质外体中活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）、抗氧化酶活性及其同功酶的变化,揭示了活性氧调控体系在红树耐盐中的作用;并通过短期盐胁迫和抑制剂处理,初步阐明了盐诱导的氧化胁迫信号与红树的耐盐性的关系,此外,还对于盐胁迫诱导的红树抗盐性基因进行了初步研究。主要结果如下:1.在长期盐胁迫下使秋茄和木榄叶片气体交换的水平显著下降,在400mM NaCl胁迫时光合速率、气孔导度、蒸腾速率均降到最低值,其中,秋茄净光合速率降低了80%,而木榄降低60%。盐胁迫对秋茄幼苗叶片光反应和暗反应的影响程度要大于木榄:（1）在400 mM NaCl胁迫时,木榄LCP（Light compensation point ）和CCP（CO₂ Compensation point）分别增加至34μmol m^-2 s^-1光子和202μmol mol^-1 CO₂,而秋茄分别提高到65μmol m^-2 s^-1光子和215μmol mol^-1 CO₂;（2）木榄AQY（Apparent quantum yield）和CE（Carboxylation efficiency）仅降低了33-35%,秋茄分别降低43-52%.2.未经盐处理的条件下,两种红树地上和地下各组织中就含有一定数量的盐离子,秋茄组织中Na⁺的含量达到0.1-0.4 mmol g^-1DW,而木榄各组织中均含有更高水平的Na⁺,同样,两种红树幼苗中都含有较高水平的Cl^-,达到0.2-0.6 mmol g^-1 DW。低盐处理（100 mM NaCl,7d）,木榄根、叶中Na⁺的含量迅速增加,高出对照近1.3倍,而秋茄根、叶中Na⁺的含量近乎于对照水平。随着盐浓度的不断提高,秋茄根中Na⁺均随之显著增加,在400 mM NaCl时比对照增加了1.6倍,而木榄根中Na⁺的含量仅比对照增加79%,这与盐处理后两种红树茎木质部汁液中Na⁺浓度的变化趋势一致,即在400 mM NaCl胁迫时,木榄茎木质部汁液中Na⁺从1.96（对照）提高到3.71μmolmL^-1,而秋茄从2.01（对照）提高到4.36μmolmL^-1,这表明木榄根系限制Na⁺离子根冠运输的能力强于秋茄。而组织中Cl^-的变化趋势与Na⁺不同,特别是在400 mM NaCl处理下,秋茄根、叶中的Cl^-含量分别增加25%,42%,而木榄相比增加121%和123%,表明秋茄根系限制Cl^-离子进入能力强于木榄,这和两种红树盐处理后茎木质部汁液中Cl^-的变化趋势大体上也是符合的。3.盐胁迫之所以对两种红树光合作用的抑制程度有所差异,主要与盐离子分布,尤其是盐离子在叶肉细胞内的区隔化有关。X-射线微区分析表明,两种红树对照植株叶片的木质部导管、表皮细胞、叶肉细胞中均含有明显的Na⁺和Cl^-。低盐处理（100 mM NaCl,7天）提高了细胞内Na⁺的水平,但盐处理后木榄叶肉细胞器中Na⁺的浓度比秋茄低23-72%,并且,木榄叶肉细胞细胞壁、原生质体和叶绿体中Cl^-的提高不显著。秋茄叶肉细胞对Na⁺的区隔化要高于Cl^-,相反,木榄叶肉细胞区隔Cl^-的能力则高于Na⁺。高盐条件（400mM NaCl处理）导致秋茄叶片维管束、表皮及叶肉细胞液泡中Na⁺的增加,而Cl^-保持或低于对照的水平。与秋茄相比,木榄叶片质外体（木质部导管、表皮细胞壁和叶肉细胞壁）和液泡中Na⁺和Cl^-的增加明显,达到30-196%。值得注意的是,木榄叶细胞的离子区隔化在以下两方面明显有别于秋茄:（1）木榄叶肉细胞液泡中Na⁺和Cl^-的水平明显高于叶绿体（盐处理秋茄的叶肉细胞液泡中Na⁺和Cl^-含量与叶绿体中的相似）;（2）与木榄叶肉细胞液泡相比,表皮细胞液泡中积累的Na⁺和Cl^-高出73-94%（秋茄叶表皮细胞液泡与叶肉细胞液泡中Na⁺和Cl^-保持类似水平）。木榄叶细胞的离子隔室化特点表明,盐处理引起木榄根系大量吸收盐离子,然而,木榄将根系吸收转运至叶细胞的盐离子区隔在液泡中,尤其是将盐离子积累在表皮细胞液泡中,这样就有效限制了叶肉中盐离子的累积,从而减轻了盐胁迫对光合器光合作用的影响。从以上可以看出,在长期盐胁迫情况下,两种红树植物控制离子平衡的机制具有不同:秋茄主要是通过拒Cl^-和增强对Na⁺的区隔化,而木榄则将Na⁺和Cl^-区隔在叶表皮和叶肉的液泡中。4.通过细胞化学方法对H⁺-ATPase进行细胞定位,并研究了H⁺-ATPase活性变化与盐胁迫的相关性。结果显示,秋茄根、叶细胞在短期低盐处理后,质膜H⁺-ATPase活性增加,而木榄叶细胞,无论是对照还是高盐处理,均检测出较高质膜H⁺-ATPase活性。非损伤扫描离子选择电极技术（Scanning Ion-selective Electrode Technique,SIET）研究表明,短期或长期盐处理,两种红树嫩根（根尖区域和伸长区）Na⁺外流明显加强,特别是木榄,Na⁺流速达到271-587 pmol cm^-2 s^-1,远远高于秋茄。Na⁺的外流应是Na⁺/H+逆向转运的结果:即在盐胁迫条件下根细胞质膜H⁺-ATPase活性增强,建立跨膜电势以及质子梯度,增强Na⁺/H+逆向转运活性,有利于将更多的Na⁺排除细胞外。木榄嫩根H+外流趋势的加强也表明其质膜H⁺-ATPase水解活性和H+转运活性的提高。与之对应,高盐处理时木榄叶和茎木质部汁液Na⁺离子并不随盐度增高而成比例增加。因此,木榄嫩根在高盐胁迫下能维持较高的排Na⁺能力,有利于其在长期盐处理条件下保持组织和细胞的离子平衡。5.长期盐处理未明显降低秋茄和木榄根、茎、叶及胚轴中K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺的水平。Na⁺/K⁺、Na⁺/Ca²⁺、Na⁺/Mg²⁺比值的提高源于Na⁺的增加。随着盐浓度的提高,秋茄根叶Na⁺/Ca²⁺、Na⁺/Mg²⁺净增加的幅度明显高于木榄,这主要是由于秋茄在高盐胁迫时不能有效控制组织中Na⁺的增加。木质部汁液中营养元素的浓度以及离子关系的变化,可以直接反映营养元素的转运情况秋茄和木榄木质部汁液中Na⁺/K⁺、Na⁺/Ca²⁺、Na⁺/Mg²⁺比值随着盐胁迫浓度的增加而提高,主要是盐胁迫引起木质部导管中Na⁺离子增加所致。短期盐胁迫对木榄细胞器中Na⁺/K⁺的影响小,却通常增加了秋茄细胞器中的Na⁺/K⁺比值,表明木榄细胞中调控Na⁺/K⁺平衡的能力强。6.长期盐处理下,两种红树叶中电解质外渗率和MDA（malondialdehyde）含量变化不明显,表明所施NaCl浓度没有造成膜质过氧化,这源于两种红树对根、叶中ROS的有效调控。实验结果显示,无论是对照还是盐处理,两种红树幼苗根中O2-.的水平高于叶片。而且400 mM NaCl处理使秋茄和木榄根中O2-.的水平提高82-83%。然而盐胁迫下两种红树组织中H₂O₂水平的变化与O2-.不同。在低盐（100 mM NaCl）处理时,秋茄叶和木榄根中H₂O₂的含量却显著低于对照水平。高盐处理（400 mM NaCl）只使秋茄叶中H₂O₂含量显著提高（257%）,而对木榄叶中H₂O₂的水平没有影响。在抗氧化酶方面,盐处理虽然提高了两种红树组织中各抗氧化酶[Superoxide dismutase （SOD）,Ascorbate peroxidase（APX）,Catalase（CAT）,Glutathione reductase（GR）]活性,但趋势有所差异:秋茄根和叶中抗氧化酶活性的提高一般体现在低盐处理时（100-200 mM NaCl）,而木榄根组织中抗氧化酶活性的显著增加多出现在高盐处理（300-400 mM NaCl）。本文对SOD、POD、APX和CAT的同工酶活性进行了电泳分离和活性测定。根叶组织中SOD同工酶（Mn-SOD、CuZn-SODs）、CAT同工酶的活性测定结果与该酶总活性的变化趋势基本一致。7.利用CeCl3染色对胞内H₂O₂进行定位研究,发现两种红树叶肉细胞壁和细胞间隙上有Ce的沉淀（CeCl3同H₂O₂的反应产物）。盐处理木榄（400mM NaCl处理96h）叶片叶肉细胞中H₂O₂ -CeCl3沉淀明显增加,增加的沉淀颗粒主要位于细胞壁和细胞间隙,与木榄相比,盐处理诱导秋茄叶肉细胞壁H₂O₂-CeCl3沉淀更明显。利用压力室的方法获取质外体汁液以研究质外体中ROS和抗氧化酶活性的的变化。结果显示,随着盐处理浓度的提高,两种红树木质部汁液中ROS（O2-.和H₂O₂）水平也随之增加,木质部汁液中SOD、CAT、APX等酶的活性也显著提高,特别是木榄,其茎木质部汁液中SOD、APX活性在整个盐处理过程中始终维持在较高水平,从而避免了质外体中的活性氧爆发。8.盐诱导的ABA信号转导途径与树木耐盐性密切相关,在盐胁迫使两种红树的根、叶中ABA（Abscisic acid）和CaM（Calmodulin）含量迅速增加,特别是在高盐胁迫时（400 mM NaCl）,木榄叶中ABA含量增加幅度显著高于秋茄。外源ABA经茎部导入,降低了叶片的Pn（Net photosynthetic rate）,Gs（Stomatal conductance）和Tr（Unit transpiration rate）,却提高叶中H₂O₂的水平和抗氧化酶活性。外源H₂O₂从茎部导入后,也提高叶内抗氧化酶活性。而利用ABA抑制剂钨酸钠进行处理,显著抑制了盐诱导的ABA水平和抗氧化酶活性的提高。因此推断,盐胁迫先诱导红树ABA增加,ABA对H₂O₂水平的提高具有促进作用,而后者能诱导红树抗氧化防御上调以维持活性氧平衡,从而有效避免了盐诱导的氧化伤害。秋茄根系在盐胁迫初期能够迅速感应盐胁迫,合成ABA,并在盐胁迫过程中,保持高的ABA含量,以上调根系中抗氧化酶（SOD, CAT,APX,GR）活性,达到耐盐的能力。在高盐处理时,木榄叶中ABA和CaM含量增加,同时,上调木榄叶中抗氧化酶活性,以保持较低的活性氧水平,提高耐盐的能力。9.秋茄幼苗分别采用100、200、300、400mM NaCl,每一浓度处理时间2-3h,从盐处理开始,24h后采样。提取盐处理秋茄幼苗叶总RNA电泳图谱,可清晰看到两条28S和18S rRNA,无降解和脱尾现象。我们从盐处理秋茄幼苗叶cDNA文库中随机挑取12个白斑克隆,PCR（Polymerase chain reaction）扩增,得到10个平均长度约为1kb大小的片断,进行测序,并进行BLAST序列同源性分析。结果表明,部分序列与番茄和马铃薯等植物的热激蛋白（Heat shoch protein,Hsp）同源,并有个别序列在GenBank中没有相似的序列信息,可能是未知功能新基因。总之,基于以上实验结果,我们初步推断两种非泌盐红树耐盐机制的主要差异如下:在盐胁迫下,秋茄植物能够通过根系控制盐离子吸收及转运,以降低地上部分盐离子的积累。再者,秋茄植物根系能够迅速感应盐胁迫,合成ABA,并在盐胁迫过程中,保持高的ABA含量,以上调根系中抗氧化酶（SOD, CAT,APX,GR）活性,达到耐盐的能力。盐处理使木榄根系吸收大量的盐离子,但其叶细胞具有较强离子区隔化的能力,尤其是对Cl^-区隔化的能力高,将盐离子主要积累在木质部导管及表皮、叶肉细胞的液泡中,这有利于降低ROS的产生。在高盐处理时,木榄叶中ABA和CaM含量增加,同时,上调木榄叶中抗氧化酶活性,以保持较低的活性氧水平,提高耐盐的能力。因此,木榄的耐盐性较秋茄更强。