【摘 要】
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木聚糖酶是一种复合酶系,主要是通过β-1,4-D-内切木聚糖酶和β-D-木聚糖酶将木聚糖降解为低聚木糖和木单糖。随着科学技术的不断发展,木聚糖酶被广泛地应用于造纸、果蔬、饲料、能源和食品等方面。相较于异养型微生物,集胞藻PCC6803可利用CO2和光能,及一些简单的无机盐,就可以实现自身生长和外源基因的表达。本研究将来自枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的含有信号肽的木聚糖酶基因s
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木聚糖酶是一种复合酶系,主要是通过β-1,4-D-内切木聚糖酶和β-D-木聚糖酶将木聚糖降解为低聚木糖和木单糖。随着科学技术的不断发展,木聚糖酶被广泛地应用于造纸、果蔬、饲料、能源和食品等方面。相较于异养型微生物,集胞藻PCC6803可利用CO2和光能,及一些简单的无机盐,就可以实现自身生长和外源基因的表达。本研究将来自枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的含有信号肽的木聚糖酶基因sxyl,以及去掉信号肽的木聚糖酶基因xyl,成功整合至集胞藻（Synechocystis sp.）PCC6803的基因组上,构建出木聚糖酶光合生物表达工程菌株。该工程菌株相较于大肠杆菌和酵母表达系统而言,可以利用光能和简单的无机盐、空气中的二氧化碳合成目的产物,极大地节约了生产成本。同时培养条件简单、不含毒素、降低了下游纯化成本。将pBluescript SK作为出发质粒分别与上游臂兼光感启动Pups、Sdw、终止子Eter以及Kana抗性KanR基因片段通过DNA重组技术相连,构建本研究所使用的整合载体pBluesys。利用重组酶将木聚糖酶基因sxyl、xyl与线性化的pBluesys质粒进行连接,构建出同源重组表达质粒pBluesys-sxyl以及pBluesys-xyl,然后利用自然转化的方法将其转入集胞藻PCC6803中,进一步筛选及验证,得到可产木聚糖酶的工程藻株PSNC9以及PSXC9。对工程藻株PSNC9以及PSXC9进行酶活测定,工程藻株PSNC9以及PSXC9所表达的酶活力分别为1.3801 U/mL和1.4161 U/mL,两者的酶活均约为野生型藻株酶活力的3.5倍,但是含有信号肽的工程藻株PSNC9并未检测到胞外分泌。对工程藻株PSXC9进行SDS-PAGE验证,重组酶蛋白大小为20KDa。通过不同pH、温度、金属离子和EDTA来探究重组木聚糖酶的酶学性质,结果表明最适催化pH值为6,最适催化温度值为60℃,Cu2+、Ca2+、EDTA对酶促反应有一定的抑制作用,Na+、Fe3+对酶促反应有一定的促进作用,其中Fe3+的促进作用最为显著,酶活力增加了约11%,而Mg2+、K+对酶促反应基本不明显。通过绘制野生型藻株和工程藻株PSXC9的生长曲线,对比两种不同藻株所含叶绿素a、总类胡萝卜素、藻蓝蛋白含量,发现工程藻株PSXC9存在生长滞后的表现。从培养条件的三个方面:温度、pH以及光照强度,对工程藻株PSXC9进行最优条件的探究,发现工程藻株PSXC9在pH为9,温度为28℃,光照强度为1400l Lux下生长状态最佳。
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