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目的：Fli-1（Friend leukemia integration-1）是属于Ets(E26transformation-specific)家族的转录因子, Fli-1的异常表达是某些类型细胞恶性转化起始阶段的重要因素。研究发现Fli-1不仅在血细胞和血管生成中起着至关重要的作用[2]，而且还具有促进肿瘤发生发展的作用[3]。基于此，本实验利用RNA干涉（RNA interference,RNAi）技术，以小鼠Fli-1基因为靶基因，设计Fli-1基因特异性的小干扰RNA（small interferenceRNA,siRNA）,构建制备目的基因Fli-1的siRNA慢病毒载体，以最适合的感染复数(optimal multiplicity of infection,MOI)感染CB3细胞，通过检测各实验组CB3细胞中Fli-1mRNA及蛋白质的表达，验证其对CB3细胞中Fli-1基因的沉默效果，并观察沉默Fli-1基因后对CB3细胞生物学特性的影响，为今后探讨其作用机制奠定了基础。方法：1．RNAi慢病毒载体的制备：针对小鼠Fli-1基因mRNA序列设计三条针对目的基因Fli-1的干扰序列，并设计阴性对照序列。合成干扰序列的单链DNA寡核苷酸，然后退火配对产生双链DNA寡核苷酸，再通过其两端所含酶切位点直接连入Age I、EcoR I酶切后的RNA干扰慢病毒载体上,将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞DH5α，对长出的单克隆菌落进行PCR鉴定,PCR鉴定阳性菌落进行测序鉴定。2．RNAi慢病毒的包装与滴度检测：按Lipofectamine2000使用说明，将慢病毒载体与辅助载体共感染293T细胞，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，离心后收集得到高滴度的慢病毒浓缩液。在293T细胞中，利用逐孔稀释法测定病毒的滴度。3．慢病毒感染CB3细胞：离心收集生长状态良好的CB3细胞进行病毒感染，为摸索CB3细胞最佳感染复数（multiplicity of infection,MOI）,根据MOI值将实验分为100、10和1三组，感染3天后，通过荧光显微镜观察绿色荧光表达情况，筛选感染效率最高组。4．慢病毒感染CB3细胞后基因沉默效果的鉴定：慢病毒感染CB3细胞96h后，分别用RT-PCR及Western blot方法测定Fli-1mRNA及蛋白质表达量。5．MTT法检测各实验组CB3细胞生长。流式细胞仪检测慢病毒感染72h后的CB3细胞的凋亡情况。结果：1．成功构建携带有Fli-1干涉序列的慢病毒载体（分别命名为Fli-1-RNAi-LV1、Fli-1-RNAi-LV2和Fli-1-RNAi-LV3），并筛选出阳性克隆，经PCR扩增及DNA测序，证实重组慢病毒表达载体构建成功。2．慢病毒载体包装后收集得到高滴度的慢病毒浓缩液，在293T细胞中利用逐孔稀释法测定病毒滴度，3个靶序列的慢病毒滴度均为:1.5E+9TU/mL。3．将病毒以不同的浓度感染CB3细胞，测得当MOI值为100时CB3细胞感染效率最高为80%。4．与阴性对照组(Negative control,NC)和未感染组(Non-infected)相比，各感染组在mRNA水平及蛋白质水平表达量明显减少(p＜0.001)，其中以Fli-1-RNAi-LV3组抑制效果最好。5．MTT法检测并分析各实验组CB3细胞生长曲线，发现各感染组较对照组及未感染组生长增殖减慢（p<0.05），各感染组间无明显差异。流式细胞仪检测慢病毒感染CB3细胞72h后细胞的凋亡情况，同对照组相比，感染组CB3细胞发生了显著的凋亡。结论：1．成功构建了Fli-1基因特异性siRNA慢病毒载体。2．利用构建的重组慢病毒包装生产出慢病毒颗粒，成功测定重组慢病毒颗粒的滴度，证实重组慢病毒可高效感染CB3细胞。3．以最适MOI值感染CB3细胞，经RT-PCR及Western blot检测，证实达到了特异性沉默CB3细胞Fli-1基因表达的目的，并可使干涉组CB3细胞生长增殖减慢，为进一步研究Fli-1基因对CB3细胞生物学行为的影响，探讨其作用机制奠定了基础。