卡波氏肉瘤(Kaposi’s Sarcoma, KS)是艾滋病的主要并发症,是艾滋病病人最重要的死亡原因之一。其病理特征以血管内皮细胞形态改变、血管增生为显著特点,流行病学观察卡波氏肉瘤可发生在多种免疫缺陷病人中,但艾滋病病人的卡波氏肉瘤却往往转化成恶性肿瘤。研究发现Tat蛋白(Trans activator of transcription)在这个进程中起了不可忽视的作用。Tat蛋白是AIDS的主要病原体HIV编码的6个调控蛋白的其中一个很重要的调控蛋白,能够促进HIV病毒转录的起始和延伸。Tat蛋白除了转录激活功能外,近年来还发现Tat蛋白具有多种其它生物活性,特别是具有较强的促血管生成的作用。Tat能够结合并激活VEGF-2受体以及整合素受体αvβ3和α5β1;可以置换胞外结合的bFGF成为溶解型,增强bFGF的作用;Tat刺激炎性细胞因子的表达及释放,增加内皮细胞生长因子反应性,促使内皮细胞向KS细胞表型的转化及新生血管形成,这些作用最终进一步促进血管生成,加重艾滋病并发症卡波氏肉瘤症状,最终加速艾滋病人死亡。硫酸化多聚甘露糖醛酸(Sulfated Polymannuroguluronate,SPMG)是从海洋褐藻中提取的并经硫酸化修饰的具有特殊分子骨架的类肝素物质,是中国海洋大学海洋药物与食品研究所研制的一类新型硫酸多糖类抗艾滋病药物,是我国第一个也是目前唯一的被批准进入临床研究的I类抗艾滋病药物,目前正处于Ⅱ期临床研究。我们在前期研究SPMG抗艾滋病分子机制时,发现SPMG与gp120有较高的亲和力(KD为1.68×10-7 M,是SPMG抑制HIV病毒进入CD4细胞的重要机制),而与Tat蛋白结合的亲和力比gp120强100多倍,KD = 8.69×10-10 M,且与其它多种糖胺聚糖相比具有较高的特异性。Tat与SPMG相互作用的结构区域为Tat的碱性氨基酸区(aa 47-57),而Tat的碱性区则是其发挥促血管生成作用最主要的功能区域,提示我们SPMG可能通过与Tat碱性区结合而发挥对其功能的抑制作用。本实验是在大量前期工作的基础上,采用分子生物学、细胞生物学、现代药理学等方法,在分子、细胞和动物三个层面上,采用共聚焦显微镜、生物芯片、免疫组化、免疫沉淀及免疫印迹等多种技术,观察了SPMG对Tat诱导的人卡波氏肉瘤来源的SLK细胞株增殖、粘附、迁移、侵袭及微管腔形成的干预作用,以及小鼠体内植如入Matrigel Plug后Tat诱导的微血管形成及SPMG的干预作用;在此基础上,研究了SPMG对Tat所诱导的VEGFR-2(Flk-1/ KDR)的活化、对Tat与整合素β1的相互作用以及Tat所介导的bFGF、VEGF的释放的影响,观察其对Tat诱导的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)中的ERK1/2、JNK以及局粘激酶(FAK)及其相关骨架蛋白Paxillin等相关信号转导通路的影响,确定SPMG拮抗Tat促卡波氏肉瘤血管生成作用的分子机制。实验中首先原核表达并纯化了具有生物活性的融合蛋白GST-Tat,活性检测实验证明GST不影响GST-Tat的活性,GST-Tat可以代替Tat用于后续细胞及分子水平的实验。1. SPMG对Tat促SLK细胞行为学改变的影响采用MTT法检测了Tat对SLK细胞增殖作用的影响以及SPMG的干预作用,结果显示,Tat能够促进SLK细胞的增殖,SPMG对Tat促SLK增殖作用具有显著的抑制作用,并呈剂量依赖性。采用Tat蛋白铺板法观察SPMG对Tat促进SLK细胞粘附能力的影响,研究表明,Tat能够诱导SLK的粘附,SPMG可以显著抑制Tat对SLK的粘附作用,且在较低剂量时(12.5μg/ml)抑制作用即明显。采用Transwell小室法观察SPMG对Tat趋化作用的影响,结果显示Tat能够诱导SLK细胞的定向迁移运动,SPMG显著抑制Tat的促SLK迁移作用,低浓度时抑制率即>50%,高浓度时则完全拮抗Tat的趋化作用。采用Transwell小室铺以重组人工基底膜(Matrigel)的方法,观察SPMG对Tat诱导的SLK细胞发生侵袭现象的影响,结果表明,Tat能够诱导SLK细胞穿过人工基底膜,SPMG显著抑制Tat的促SLK侵袭作用,高、中、低浓度的抑制率均>50%。2. SPMG体内外拮抗HIV-1 Tat的促血管生成作用体外实验观察了SPMG对Tat诱导的SLK细胞在Matrigel上形成管腔的影响,结果表明SPMG能够显著拮抗Tat的诱导作用。SPMG低浓度时,小管数目减少、形状不完整;高浓度时,SLK几乎无法形成小管。体内实验采用Matrigel plug的方法,将Tat单独或与SPMG一起与Matrigel混匀后注入C57BL/6小鼠的腹侧,7天后取出Matrigel plug,做成石蜡切片后组织化学染色观察微血管的形成,免疫组织化学染色观察内皮细胞特异性标志物CD31的表达。实验结果表明,Tat能够诱导内皮细胞在植入C57BL/6小鼠体内的Matrigel plug中形成微血管,SPMG能够显著拮抗Tat的这种诱导作用,组织化学染色显示SPMG组微血管数量变少,免疫组织化学染色显示CD31的表达量明显减少。3. SPMG拮抗HIV-1 Tat的促KS血管生成作用的分子机制实验采用免疫沉淀及免疫印迹的方法,首先进行了SPMG对Tat与VEGFR-2(KDR)之间相互作用及其相关信号通路的研究,结果显示:Tat诱导SLK细胞上KDR的自身磷酸化,SPMG拮抗Tat诱导的KDR磷酸化,并且抑制KDR磷酸化后激活的相关信号分子ERK1/2以及JNK的磷酸化。在研究Tat与整合素β1的结合及SPMG干预作用的实验中,发现Tat能够与SLK细胞整合素β1的结合,SPMG拮抗二者的结合;进一步对整合素活化引起的相关信号通路的进行研究,发现SPMG能够抑制Tat与整合素结合后诱导的FAK和Paxillin的磷酸化。实验最后采用ELISA法检测了SLK细胞与Tat共孵育时,培养液中游离型bFGF和VEGF的含量的变化以及SPMG存在时所产生的影响。实验结果显示,Tat能够促进bFGF和VEGF的释放,SPMG则能够拮抗Tat的这种作用,对bFGF的影响远远大于对VEGF的影响。总之,我们首次研究并证明新型抗AIDS侯选药物SPMG能够拮抗Tat的促KS血管生成作用,其作用的发挥与SPMG与Tat碱性区之间的相互作用有关。研究所揭示的SPMG拮抗Tat所介导的KS血管生成作用及其分子机制,对阐释SPMG抑制艾滋病相关卡波氏肉瘤的作用提供了理论根据,为SPMG抗艾滋病的临床应用提供了有益的补充,对于拓展糖类药物在艾滋病治疗中的应用范围、增加新适应症具有非常重要的意义。