胡杨PePYLs与PeCBF4α的基因功能研究

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植物生命周期中,多种非生物胁迫会导致植物缺水。植物通过改变代谢和基因表达进而影响自身的生长和发育,以应答环境中的水分亏缺胁迫。植物激素脱落酸(ABA)在植物抗逆性形成中发挥重要作用,ABA受体PYLs(Pyrabactin Resistance-Like)是ABA信号途径的核心元件。C-repeat结合蛋白(CBFs)在植物抗干旱、低温、盐逆境应答中发挥关键作用,其中拟南芥CBF4基因的表达属于ABA依赖型。然而胡杨的PYLs与CBFs研究十分有限。本论文通过研究胡杨PePYLs家族基因和PeCBF4a基因的非生物胁迫下的表达特征及功能,并将PePYLs和PeCBF4a基因分别在拟南芥和三倍体毛白杨中进行遗传转化,逆境处理后测量生理生化特性并分析转基因植株的抗逆性,从而了解胡杨PePYLs和PeCBF4a在ABA信号调控的植物逆境响应分子机制中的作用。主要研究结果如下:(1)首次鉴定了杨树的14个PYLs成员,从胡杨中克隆得到12个基因(PePYL1/3/4/6/7/8/9/10/11/12/13/14)。其中 GFP-PePYL3,GFP-PePYL4,GFP-PePYL6,GFP-PePYL9和GFP-PePYL11定位于细胞核和质膜。PePYLs表达模式存在显著差异:PePYL1/3/4/6/9/11的表达受ABA强烈诱导;PePYL6在低温处理下表达上升;PePYL3/6/9则受干旱诱导;PePYL1/3/6表达量受盐诱导的变化不显著,而PePYL4/9/11在盐处理下表达下降。结果表明,不同部位表达的PePYLs受ABA变化的调节并与逆境胁迫相关。(2)培育了超表达PePYL4/6/9的拟南芥(PePYL4-OE,PePYL6-OE,PePYL9-OE)及其突变体的回补株系。PePYL4-OE在1 μM ABA培养基中的种子萌发率只有14.08%,PePYL6-OE和PePYL9-OE种子的萌发率下降水平相似。在5/10/15/20 μM ABA培养基中的超表达株系的根长度显著减少。结果表明,这三个PePYLs的组成型表达增强了拟南芥种子萌发和根生长阶段对ABA抑制作用的敏感性。(3)比较了不同浓度甘露醇培养基中的转基因拟南芥的萌发率,结果显示超表达PePYL4,PePYL6,PePYL9植株的幼苗提高了对低浓度甘露醇的渗透胁迫抗性,高浓度甘露醇下却没有明显差异。另外对拟南芥成苗进行控水干旱处理后得到以下结果:①超表达株系的平均相对含水量(RWC)减少了 9.43%,而Col-0和突变体株系则下降了 18.47%和18.14%,回补株系下降了 13.29%;②相对于Col-0和突变体植株,正常条件下PePYLs-OE和回补株系的平均光合速率(Pn)增加了 33.29%、平均水分利用效率(iWUE)增加了 92.77%,而在干旱处理下Pn增加了 75.74%、iWUE增加了 217.21%;③转基因株系的平均脯氨酸含量是突变体和回补株系均值的1.43倍,是 Col-0 的 1.27 倍。结果表明,PePYL4-OE、PePYL6-OE、PePYL9-OE 具有较高的干旱胁迫耐受性,基因PePYL4/6/9在ABA调控的逆境响应中起正向调节的作用。(4)克隆了胡杨PeCBF4a基因,它的表达受ABA、脱水干旱、低温和盐的诱导。另外培育了超表达PeCBF4a(PeCBF4a-OE)及空载体遗传转化的转基因三倍体毛白杨(Populus tomentosa ’YiXianCiZhu B385’)。野生型和空载体转化的白杨被用作对照组。通过对转基因杨树进行干旱、低温、盐等处理后得到以下结果:①PeCBF4a-OE 比对照组的 Pn 提高 34.7%-165.7%,iWUE 提高 48.9-103.7%;②PeCBF4a-OE杨树的最大光化学量子产量(Fv/Fm)在逆境处理前后没有显著改变,但却高出对照组2.14-5.89%。PeCBF4a-OE的非光化学淬灭值(NPQ)比对照组下降了12.02-23.64%,而其光化学淬灭值(qP)高出对照组8.75-22.31%;③PeCBF4a-OE株系具有较高的超氧化物歧化酶(SOD)活性,并且显著降低脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量;④PeCBF4a-OE株系积累更多渗透调节物质,如脯氨酸和可溶性糖(果糖、葡萄糖和蔗糖)等;⑤PeCBF4a-OE杨树强烈诱导PeCBF4a的下游逆境应答基因PtRCI2A(低温/盐相关蛋白质)和PtDI21(干旱诱导蛋白)的表达,其中PtRCI2A的表达量增加了 3.5-25.2倍,PtDI21的表达量增加了 4.6-61.2倍。另外在正常培养条件下,PeCBF4a导致了转基因杨树的矮化表型;通过P-V曲线的测量结果,我们发现PeCBF4a-OE植株的初始质壁分离时的相对含水量和相对渗透水含量低于对照组,PeCBF4a-OE的渗透调节能力增强。结果表明,转基因PeCBF4a-OE杨树增强了干旱、低温、盐胁迫的耐受性,PeCBF4a在植物逆境胁迫响应中可能发挥积极作用。本文通过对胡杨中ABA受体PYLs的同源基因PePYLs,及ABA信号调控的逆境应答相关转录因子PeCBF4a展开研究,并分别将其进行拟南芥和三倍体毛白杨的遗传转化和抗逆性分析,我们发现不同部位表达的PePYLs受ABA变化的调节,PePYLs-OE具有较高的干旱胁迫耐受性;PeCBF4a基因的表达受非生物胁迫条件的诱导,PeCBF4a-OE杨树增强了干旱、低温、盐胁迫的耐受性。基因PePYL4/6/9与PeCBF4a在胡杨ABA调控的逆境胁迫响应中可能发挥积极作用,为胡杨ABA信号调控植物逆境响应分子机制的研究和利用PePYLs和PeCBF4a基因改良植物抗性提供了一定的理论基础。
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