鸡奇异变形杆菌病(Proteus mirabilis disease)是近年来国内新发现的一种急性热性细菌性传染病。本病的特征是呼吸困难、咳嗽、体温升高、腹泻。病鸡主要表现为菌血症、败血症,一侧性或两侧性瘫痪或水样腹泻,各种日龄的鸡群都可感染本病,但以7周龄以下的雏鸡最易感。种鸡感染本病后可通过种蛋传给后代,从而造成雏鸡的大批死亡。此病十分容易造成爆发性流行疾病,对养殖业是一种潜在的威胁。孙秋艳等曾采用自制奇异变形杆菌诊断抗原,对来自于河南、安徽、山东、广西等省(自治区)的血清进行流行病学调查,结果表明奇异变形杆菌抗体阳性率普遍较高。目前,奇异变形杆菌的检测多采用传统的分离鉴定方法。随着分子生物学检测技术的发展和广泛应用,有国外学者对奇异变形杆菌的PCR检测方法做过相关的研究。国内2008年首次有相关报道,但到目前为止,国内关于鸡奇异变形杆菌的PCR及16srRNA等分子方面的检测还未见报道。近年来实验证明,细菌细胞膜中的一种重要组成成分外膜蛋白(OMP)具有良好的免疫原性,不仅可刺激体液免疫,而且也可刺激细胞免疫作用。因此本试验通过对分离菌QY进行常规等综合鉴定,确定分离的QY为奇异变形杆菌,又进一步对其16SrRNA基因序列进行测定及分析,建立了系统进化树。提取了鸡奇异变形杆QY的OMP,对其免疫原性进行试验;同时用提取的OMP制备了兔抗鸡奇异变形杆菌OMP高免血清,建立了标记抗体检测方法,为快速检测鸡奇异变形杆菌病原或抗体奠定了基础。本研究主要包括以下内容:一、鸡奇异变形杆菌分离鉴定及16SrRNA基因序列测定、系统进化分析从山东泰安一鸡场发病雏鸡分离到一株致病菌QY,通过细菌形态学等常规鉴定符合奇异变形杆菌特性。用奇异变形杆菌诊断抗原血清学诊断结果呈阳性,人工感染证明该菌株是造成该场雏鸡大批发病死亡的致病菌。药敏试验结果显示对头孢类、恩诺沙星等高度敏感,而对青霉素和复合磺胺等不敏感。以细菌16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增,得到QY的16S rRNA基因序列,长约1453bp(GenBank登录号为GU477712)。将该序列与GenBank中序列进行BLAST比对,发现与其匹配度最高的均是奇异变形杆菌各株系的16SrRNA序列,均高达98%以上。运用DNAStar软件与其中10株奇异变形杆菌分离株构建系统进化树,结果表明QY株与10个代表菌株的同源性均在98.9%-99.9%之间,其中与AB272366同源性最高为99.9%。从分子水平证明该菌是奇异变形杆菌并分析了其遗传进化规律,为鸡奇异变形杆菌的鉴定及其疾病的诊断与治疗提供了参考。二、鸡奇异变形杆菌外膜蛋白提取及免疫原性的检测采用改良的方法提取了鸡奇异变形杆菌QY的OMP,通过测定其含量为5.741mg/mL,采用凝胶层析柱分离纯化方法获得分子量为43.0KD的QY有效保护抗原成分(OMP43.0),制备油乳剂QY全菌和OMP抗原、OMP43.0抗原,分别免疫1日龄雏鸡两组。其中一组分别测相应抗体水平并分析抗体动态变化;另一组在免疫14d后,用100 LD50的QY攻毒,统计保护率。结果免疫后7d时,抗体水平开始逐渐上升,42d时,抗体水平分别达到最高,然后逐渐下降,70d时仍保持较高的抗体水平。主动免疫时,OMP和OMP43.0免疫组均得到较高的保护,高于QY全菌免疫组。OMP、OMP43.0和全菌抗原均具有良好的免疫原性和免疫保护作用,为奇异变形杆菌OMP亚单位疫苗的研制奠定了良好的理论基础。三、鸡奇异变形杆菌OMP高免血清的制备及标记抗体检测方法的建立将提取的鸡奇异变形杆菌OMP免疫健康新西兰家兔,每周免疫1次,共计免疫4次,获得了兔抗鸡奇异变形杆菌OMP高免血清,建立了检测鸡奇异变形杆菌的间接IFA和ELISA的方法,并对其工作条件进行了优化和筛选,试验结果表明IFA兔高免血清稀释度为1:160,FITC标记羊抗兔IgG稀释度为1:40,感作时间为45min,鸡奇异变形杆菌特异性黄绿色荧光最清晰,非特异性荧光最弱。间接ELISA抗原、抗血清最佳工作浓度分别为10ug/mL、1:800,酶标二抗工作浓度为1:5000,最佳包被条件为4℃、24h包被;最佳封闭条件为37℃、1h;经临床检测证明该两种方法均具有简便、快速、特异性强的特点,为鸡奇异变形杆菌病的流行病学、血清学调查和临床快速诊断奠定了基础。