眼组织结构的完整性对于维持正常视功能具有重要意义，此种组织结构完整性的维持有赖于多种机制，其中最重要的机制之一是眼内赦免机制。有实验表明，前房是重要的免疫赦免区，对维持眼内免疫微环境的稳定性有重要作用。 虽然诸多研究证明眼-脾轴的完整性、眼部微环境(如TGF-β、Fas ligand)等对ACAID的诱导具有重要作用，但ACAID诱导外周免疫耐受的机制仍不完全清楚。目前认为对免疫反应具有抑制作用的调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)是维持机体外周耐受的重要组成部分，而负性调节分子是参与Treg抑制作用的主要因素之一。 综上所述，ACAID是机体的重要免疫赦免机制之一，对于正常视功能的维持具有重要意义；而PD-1:PD-L作为一种免疫抑制通路参与外周耐受的形成与维持，因此我们推测它对ACAID的诱导可能具有重要作用。本课题正是基于上述研究的最新进展，在我们以往的研究基础上设计出来的。本课题首先用卵白蛋白(ovalbumin，OVA)诱导ACAID，建立ACAID的动物模型；其次利用荧光定量实时聚合酶链反应(fluorescent quantitative real-time polymerase chain reaction，FQ-PCR)、Western免疫印迹、免疫组织化学方法、流式细胞技术(flow cyctometricanalysis，FCM)等从mRNA和蛋白水平、细胞数量、表型等方面检测ACAID小鼠脾脏和虹膜睫状体上PD-l及其配体的表达；最后通过增殖实验、过继转移实验、酶联免疫吸附实验(enzyme-1inked immunosorbent assays，ELISA)等方法探讨了ACAID小鼠脾脏PD-l<+>细胞的功能特征，旨在阐明PD-1及其配体与ACAID形成之间的关系。 本课题的研究主要分为以下三部分： 第一部分ACAID模型的诱导和鉴定 目的：通过前房注射OVA来诱导ACAID，为实验研究提供可靠的动物模型。 方法：采用乙醚吸入法麻醉小鼠，在手术显微镜下用玻璃微量注射针将2μlOVA(20mg／m1)溶液注入小鼠前房；前房注射后第7d于小鼠后足垫内皮下注射100μl OVA(2.5mg/ml)溶液与等体积弗氏完全佐剂的混悬液，总体积为0.2ml;7d后于小鼠右耳廓皮内注射20μl OVA(10mg／ml)溶液，左耳廓皮内注射等量无菌磷酸盐缓冲液，24h后检测DTH反应。 结论：通过检测DTH反应表明，前房注射OVA抗原100μg可诱导出ACAID，这为以后的实验研究提供了稳定可靠的动物模型。 第二部分PD-1及其配体在ACAID小鼠脾脏和虹膜睫状体中的表达 目的：检测ACAID小鼠脾脏和虹膜睫状体中PD-1及其配体在mRNA和蛋白水平的表达。 方法：(1)用Primer express 2.0软件设计引物和探针，应用FQ-PCR检测各组小鼠脾脏和虹膜睫状体中PD-1、PD-L1和PD-L2 mRNA的表达。 (2)应用化学发光Western免疫印迹法检测各组小鼠脾脏PD-1、PD-L1和PD-L2的蛋白表达。 (3)用ABC法进行免疫组织化学染色，观察各组小鼠虹膜睫状体中PD-1和PD-L1阳性细胞的形态、分布及数量变化。 (4)取各组小鼠脾脏制备单细胞悬液，FCM方法分析PD-1在CD3<+>、CD3<+>CD4<+>和CD3<+>CD4<->T细胞上的表达。 结果 (1)FQ-PCR结果显示，在各组小鼠脾脏中均发现PD-1、PD-Ll和PD-L2mRNA的表达；在ACAID小鼠中，此三种分子的mRNA表达显著增高。 在各组小鼠的虹膜睫状体中仅有PD-1和PD-Ll mRNA的表达，没有检测到PD-L2mRNA的表达；PD-1mRNA的表达在ACAID小鼠中显著增加，而PD-L1mRNA的表达在阳性对照组中显著增加。 (2)Western免疫印迹结果显示，各实验组中于相对分子质量为55kDa、43kDa和42kDa区可见PD-1、PD-Ll和PD-L2特异的阳性印迹带，且三者蛋白的表达水平均在ACAID组中显著增高。 (3)免疫组织化学染色结果显示，PD-1和PD-L1阳性细胞多呈圆形或类椭圆形，主要分布于虹膜根部和瞳孔缘区，部分细胞沿虹膜血管排列，PD-1阳性细胞数在ACAID小鼠中增加，而PD-L1阳性细胞数在阳性对照组中增加。 (4)FCM结果显示，在各组小鼠脾脏CD4<+>、CD4<->(CD8<+>)T细胞中仅有少量的PD-1表达，PD-1在CD4<+>T细胞上的表达显著高于其在CD8<+>T细胞上的表达，CD4<+>PD-1<+>T细胞在ACAID小鼠中的表达显著增高。 结论：在小鼠的虹膜睫状体中，PD-1在ACAID小鼠中表达显著增加，PD-Ll在阳性对照组中表达增高，PD-L2没有表达。在小鼠的脾脏中，PD-1、PD-L1和PD-L2的mRNA和蛋白的表达在ACAID小鼠中均显著增加，且PD-1高表达在CD4<+>T细胞上，提示PD-1可能参与了ACAID的诱导。 第三部分 ACAID小鼠脾脏CD4<,+>PD-1<+>T细胞的功能特征 目的：探讨小鼠脾脏CD4<+>PD-1<+>T细胞的功能特征，评价其在ACAID形成中的作用。 方法： (1)应用免疫磁珠细胞分选(magnetic affinity cell sorting，MACS)方法分选各组小鼠脾脏CD4<->、CD4<+>PD-1<+>和CD4<+>PD-1<->T细胞，在lμg/ml anti-CD3 mAb的刺激下分别培养72h，<3>[H]-标记甲基胸腺嘧啶(<3>[H]-TdR)法分别检测CD4<+>PD-1<+>和CD4<+>PD-1T细胞的增殖情况。将分选后的CD4<+>PD-1<->T细胞与CD4<+>PD-l<+>T细胞按照不同比例进行混合培养，分别加入100μg／ml OVA及基础培养液，<3>[H]-TdR法测定CD4<+>PD-1<->T细胞的增殖情况。 (2)MACS方法分选各组小鼠脾脏CD4<->和CD4<+>PD-1<+>T细胞，在100μg／mlOVA的刺激下培养48h，ELISA方法检测培养上清中IL-10水平。 (3)将分选后的CD4<+>PD-1<+>和CD4<+>PD-1<->T细胞分别注入正常BALB／e小鼠尾静脉，3d后予常规皮下免疫，7d后检测DTH反应。 (4)制备各组小鼠脾脏单细胞悬液，按照细胞表面和细胞内染色的方法分别与anti-CD4、CD25、PD-1和Foxp3 mAb进行孵育，FCM分析CD4<+>PD-1<+>T细胞与CD4<+>CD25<+>Treg的关系。 结果：(1)在anti-CD3 mAb的刺激下，各组CD4<+>PD-1<+>T细胞的增殖水平均较低，而各组CD4<+>PD-1<->T细胞则具有较强的增殖能力，与CD4<+>PD-1<+>T细胞比较有显著性差异。 将CD4<+>PD-1<+>T细胞与CD4<+>PD-1<->T细胞按照不同比例进行混合培养，在OVA刺激下，ACAID小鼠CD4<+>PD-1<+>T细胞对CD4<+>PD-1<->T细胞的抑制能力显著增强，且其抑制活性具有剂量依赖性。 (2)ELISA结果显示，ACAID小鼠CD4<+>PD-1<+>T细胞分泌高水平的IL-10，与对照组比较有统计学意义(P<0.05)。 (3)过继转移实验结果显示，将ACAID小鼠脾脏CD4<+>PD-1<+>T细胞过继转移入正常BALB／c小鼠体内后，用OVA诱导的DTH反应受到抑制，而用牛血清白蛋白诱导的DTH反应没有被抑制；将CD4<+>PD-1<->T细胞过继转移后不能抑制DTH反应，提示ACAID小鼠脾脏CD4<+>PD-1<+>T细胞能够抑制抗原特异性的DTH反应。 (4)FCM结果显示，约有23.8％的CD4<+>PD-l<+>T细胞表达CD25和Foxp3分子；约有13.3％的CD4<+>PD-1<+>T细胞仅表达CD25分子；约有57.38％的CD4<+>PD-1<+>T细胞同时为CD25<->Foxp3<->细胞；各组间比较无统计学差异(P>0.05)。 结论：ACAID小鼠脾脏中CD4<+>PD-1<+>T细胞能够分泌大量的IL-10、抑制抗原特异性的细胞增殖和DTH反应；CD4<+>PD-1<,+>T细胞与CD4<+>CD25<+>Treg部分重叠。提示CD4<+>PD-1<+>T细胞可能作为一类Treg的亚群参与ACAID的诱导。