日本脑炎(Japanese encephalitis,JE)也称乙型脑炎,是一种由乙脑病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)引起的、经蚊子叮咬传播的急性人畜共患病。JEV能够突破血脑屏障,破坏中枢神经系统,造成人死亡或留下神经系统后遗症,使母猪流产、公猪发生睾丸炎。商品化弱毒疫苗可能会毒力返强。野生动物园动物、犬一般都没有免疫JE疫苗;目前,对JEV在野生动物、犬的流行规律的研究不是很清楚,而且JEV突破血脑屏障(Blood brain barrier,BBB)致病的分子机理不清楚,尚无有效药物能够彻底治愈此病。已知大部分黄病毒科病毒都是由接种乳鼠而分离得到,小鼠是研究JEV致病机理的理想模型。γ干扰素(Interferon gama,IFNG,IFN-y)在调控先天性免疫、细胞免疫、血脑屏障和炎症反应方面发挥着重要的作用,但是IFN-γ在JE致病过程中的分子机理尚不清楚。microRNA(miRNA)是宿主或某些病毒产生的一种大约22-24 nt的非编码RNA,在转录后调节中发挥重要作用。因此,本研究对昆明和上海野生动物园的部分野生动物及全国部分省份的犬,进行JEV的血清流行病学调查;利用噬菌体表面展示技术对JEV病毒粒子进行亲和小肽筛选;建立JEV感染野生型和IFNG受体(Interferon gama receptor,IFNGR)缺失乳鼠的JE模型,采用全基因转录组高通量测序(RNA sequencing,RNA-seq)的方法,对感染和未感染JEV的乳鼠脑组织进行mRNA和miRNA转录组测序、分析和验证,具体参见以下内容:1、JE流行病学调查多种哺乳动物和禽类被带毒蚊子叮咬后都能感染JEV,而且可能作为中间宿主使JEV被传播和扩散。但是JEV在各种易感动物和传播媒介之间的流行规律尚不清楚。因此,本研究采集了全国各省份犬的血清,及上海野生动物园和昆明野生动物园内,部分野生动物的血清,利用血凝抑制试验(Hemagglutination inhibition test,HI),噬斑减少中和试验(Plaque reduction neutralization test,PRNT),以及 JEV 囊膜结构域Ⅲ蛋白(Envelope domain Ⅲ,Ed Ⅲ)作为包被抗原的间接酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immuno sorbent assay,ELISA)方法,对血清中的JEV抗体进行了检测;又利用鉴别诊断基因Ⅰ型和基因Ⅲ型JEV抗原的实时定量PCR方法(Quantitative realtime Reverse Transcription PCR,qRT-PCR)对血清中的JEV抗原进行了检测。结果:野生动物的JEV HI抗体阳性率为36.8%,犬的阳性率55.6%;野生动物中哺乳动物的血清抗体阳性率高于禽类;部分省份犬的血清阳性率较高;PRNT,间接ELISA检测结果基本与HI试验结果一致;采用qRT-PCR对部分血清中JEV抗原的检测结果显示主要以基因III型JEV抗原为主。结论:野生动物园动物、犬的血清中均有JEV抗体和抗原存在,需要对这些动物建立起科学的血清流行病学监测机制,才能更好的防控JE。2、噬菌体表面展示技术筛选JEV亲和肽为了寻找JEV受体,获知中和JEV的表位序列,本研究利用噬菌体表面展示技术,对白纹伊蚊C6/36细胞系扩增的NJ2008株JEV,进行亲和筛选,获得了对JEV具有亲和作用的噬菌体克隆。通过亲和验证和序列测定,最终得到23条小肽序列。体外抗病毒试验表明,这些小肽能够阻止JEV侵入细胞,对JEV具有中和作用。对抗病毒效果最好的三条小肽,分别进行辣根过氧化物酶(HRP)和FITC荧光标记,通过夹心ELISA和免疫荧光试验发现,这三条小肽均能结合到JEV抗原上。结论:成功筛选到对JEV具有亲和作用的小肽,为寻找JEV受体,开发抗JEV药物,对JEV抗原进行鉴别诊断,提供了有益的借鉴。3、JEV感染野生型和IFNGR缺失乳鼠致病模型的建立为了研究JEV感染野生型和IFNGR缺失乳鼠后破坏血脑屏障的致病机理,本研究使用C6/36细胞系扩增NJ2008株JEV,腹腔注射9日龄乳鼠,建立神经外感染模型。采用攻毒后每天腹腔注射伊文氏蓝(Evan’sblue)染料法观察JEV对乳鼠血脑屏障的破坏情况;采用qRT-PCR检测攻毒后乳鼠脑中JEV滴度的变化情况;又采用抗JEV EdⅢ单抗对乳鼠脑中JEV抗原分布情况进行免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)分析;最后对攻毒后第四天的乳鼠脑皮质进行透射电子显微镜(Transmission electron microscopy,TEM)观察细胞内的超微结构变化及JEV病毒粒子的分布。结果:攻毒的野生型乳鼠在第四天开始出现神经症状,第五天出现死亡,而攻毒的IFNGR缺失乳鼠在第五天开始出现症状,在第五天或第六天出现死亡;BBB被JEV破坏的时间,攻毒的野生型乳鼠为第四天,而IFNGR缺失乳鼠为第五天;攻毒后两种乳鼠脑中的JEV含量,在第三天和第五天没有显著差异(P>0.05),而在第四天有显著差异(P<0.01),而且攻毒的野生型乳鼠脑中JEV显著多于IFNGR缺失攻毒乳鼠;IHC分析结果显示,在攻毒后第四天野生型乳鼠脑皮质的JEV抗原明显多于IFNGR缺失乳鼠;TEM观察结果显示,在攻毒后第四天刚出现神经症状的野生型乳鼠,脑皮质微血管内皮细胞周围水肿严重,BBB被破坏较严重,被感染的细胞发生死亡、破裂、溶解,能观察到JEV颗粒;而对于IFNGR缺失乳鼠,在攻毒后第四天,BBB被破坏的情况不太严重。结论:JEV感染9日龄野生型乳鼠,BBB被JEV破坏的时间早于IFNGR缺失乳鼠,造成死亡的时间早于IFNGR缺失乳鼠,JEV感染两种乳鼠均引起死亡。4、感染JEV的野生型乳鼠和IFNGR缺失乳鼠脑的mRNA转录组研究为了深入研究JEV感染野生型和IFNGR缺失乳鼠后破坏血脑屏障致病的分子机理,本研究取攻毒后第四天野生型和IFNGR缺失乳鼠完整的脑组织提取总RNA;采用RNA-seq建库试剂盒进行建库;合格后,采用Illumina公司的高通量测序(Hi-seq 2000)技术,进行全基因mRNA转录组测序,并进行分析和验证。结果:成功建立了四组十个JEV攻毒与未攻毒的野生型和IFNGR缺失乳鼠脑的测序文库;四组数据的组内相关性较好,组间有显著差异;以矫正后p值(padj,q)<0.05为标准,获得攻毒与未攻毒的野生型乳鼠之间(WT_TvsWT_C)和攻毒与未攻毒的IFNGR缺失乳鼠(KO_T vs KO_C)之间的差异基因分别为2502个和628个;未攻毒的野生型乳鼠和IFNGR缺失乳鼠(WT_C vs KO_C)之间的差异基因59个;攻毒的野生型乳鼠和IFNGR缺失乳鼠(WT_T vs KO_T)之间的差异基因1181个。差异基因的功能聚类(Geneontology,GO)分析发现:WT_TvsWT_C,KO_TvsKO_C,WT_TvsKO_T,主要富集在免疫、病毒防御等生物学过程,细胞组分,分子功能等三个层面。差异基因的信号通路(KEGG)分析发现:WT_T vs WT_C,KO_T vs KO_C,WT_T vs KO_T,主要聚类在细胞因子及其受体相互作用、肿瘤坏死因子、Toll样受体、NF-κB、破骨细胞分化、Jak-STAT等与先天性免疫,炎症反应有关的信号通路;WT_C vs KO_C没有任何显著富集的信号通路。重点对KO_T vs WT_T和KO_C vs WT_C维恩分析,筛选出的IFNGR敲除后应对JEV的差异基因(Set A),进行了 GO和KEGG分析。又采用qRT-PCR的方法,对前述随机挑选的差异基因,及Set A基因所富集的信号通路中的关键基因进行验证,结果与高通量测序的结果基本一致。结论:成功获得四组差异mRNA转录组数据,对IFNGR敲除后应对JEV感染的差异基因进行了分析和验证,为深入研究JEV突破BBB的分子机理,以及IFNGR信号通路在JEV感染中的分子机理奠定了基础。5、感染JEV的野生型和IFNGR缺失乳鼠脑的miRNA转录组研究为了寻找JEV感染野生型和IFNGR缺失乳鼠脑的关键miRNA,在前期建立的乳鼠JE模型基础上,取攻毒后第四天及对照组乳鼠完整的脑组织,进行全基因miRNA转录组的RNA-Seq试验,并进行分析、验证。结果:共得到1324个已知的小鼠成熟miRNA,107个新miRNA。经过DGEseq分析,JEV感染与未感染的野生型乳鼠相比(W_T vs W_C),11个miRNA上调,1个miRNA下调;JEV感染与未感染的IFNGR缺失乳鼠相比(K_T vs K_C),4个miRNA上调;未感染的野生型乳鼠和IFNGR缺失乳鼠相比(W_CvsK_C),2个miRNA上调,2个miRNA下调;JEV感染的野生型乳鼠和IFNGR缺失乳鼠相比(W_T vs K_T),2个miRNA上调。通过miranda来预测miRNA的靶基因,根据靶基因的富集程度分别进行GO和KEGG信号通路分析。GO分析显示,miRNA主要参与分子功能、细胞组分和生物学过程的调控。KEGG信号通路分析显示,miRNA主要参与Jak-STAT、Toll样受体、NF-KappaB、凋亡等信号通路。结论:成功获得四组差异miRNA转录组数据及其预测靶基因的生物学意义,获得差异和关键的miRNA,为更深入的研究防治JE提供切实有用的依据。6、感染JEV的野生型和IFNGR缺失乳鼠脑的差异miRNA与mRNA的关系研究为了进一步精确地获得差异表达的miRNA所对应的差异表达的靶基因mRNA,根据miRNA与其靶基因mRNA的负相关性,利用转录组测序所筛选的差异基因,进行如下分析:上调表达的miRNA和下调表达的mRNA,下调表达的miRNA和上调表达的mRNA,寻找miRNA所对应的靶基因,并对这些关联基因进行GO和KEGG分析。JEV感染野生型乳鼠后,1739个mRNA表达量上调,763个mRNA表达量下调,而miRNA上调11个,下调1个。JEV感染IFNGR缺失乳鼠后,576个mRNA表达量上调,52个mRNA表达量下调,而miRNA上调4个。感染JEV的野生型与IFNGR缺失乳鼠相比,有797个mRNA表达量上调,384个mRNA表达量下调,而miRNA上调2个。未攻毒的野生型乳鼠与IFNGR缺失乳鼠相比,有31个mRNA表达量上调,28个mRNA表达量下调,而miRNA上调2个,下调2个。结果发现,差异表达的miRNA,所调节的差异mRNA主要参与免疫、凋亡、细胞因子的产生等生物学过程。以及Toll样受体、TNF、RIG-I样受体、细胞因子以及凋亡等相关的信号通路。从关联分析的结果中,我们用双荧光报告系统测定了 miR-147-3p和STAT6,miR-27a-3p 和 IRF9、miR-203-3p 和 IL12B,miR-21a-3p 和 USP,miR-223-3p 和 IL6,miR-142-5p 和 CD28,miR-223-3p 和 IL11R,miR-21a-5p 和 STAT1,miR-203-3p 和OASL2,miR-21 a-3p 和 CD22,miR-203-3p 和 MYD88,miR-142b 和 TNFSF9,miR-155-5p和 TNFSF9,miR-142-3p 和 IL7,miR-27a-3p 和 IFIT3 的作用,结果显示 STAT6,USP,IL11R,STAT1,OASL2,CD22,MYD88,TNFSF9,IL7 和 IFIT3 的荧光值下降的比较显著。结论:成功获得四组差异miRNA及其差异表达的靶基因mRNA,及其生物学意义,并对相关性分析获得的miRNA和mRNA的靶向关系进行了双荧光素报告试验验证。