目的：氟与人体生命活动及牙齿、骨骼组织代谢密切相关。一方面，氟是预防龋齿有益的微量元素之一，另一方面，人体长期暴露在高氟环境下，从外界环境获得氟超过生理需要，可导致全身慢性中毒，成为地方性氟中毒。课题组前期研究采用基因芯片的方法对氟骨症患者外周血淋巴细胞基因差异表达进行了筛选发现对照组与氟骨症组比较后从中选出ras，TM9SF1，COL9A3，Mcm3四个基因予以研究。随后发现Mcm3基因在小鼠成骨细胞染氟后，表达上调可达2.5倍，显示出可能具有氟中毒早期生物标志意义。　　 首先在人群中用荧光定量PCR技术验证Mcm3在暴露和非暴露组间的差异，与此同时测定和分析两组的肝肾功能和transmembrane 9 superfamily member 1（TM9SF1）的表达。然后对Mcm3基因（minichromosome maintenance deficient 3）在氟中毒体外模型中的表达特征予以证实，同时观察在不同剂量氟作用下体外培养成骨细胞中Mcm3基因在增殖成骨细胞中的表达情况，以及对细胞增殖，氧化应激，内质网应激，骨转化（碱性磷酸酶、骨钙素、骨涎蛋白、骨桥蛋白、Runx2、 Osterix、collagen I）情况，以求较完整的反应氟中毒情况下Mcm3表达的变化和细胞内其它分子反应的概况，并在此基础上探讨氟骨症发病可能的关键环节与调控机制，更进一步揭示氟中毒所致氟骨症的分子发病机制，为氟骨症的早期诊断及治疗提供科学依据。　　 方法：　　 （1）选取饮水型氟中毒轻度暴露者、对照各11例，采用SYBRGreen1嵌合荧光法进行实时定量PCR的方法，检测氟中毒暴露者和对照组外周血淋巴细胞中Mcm3和TM9SF1 mRNA的表达。生物化学方法测定两组血清的反映肝、肾功能状态的指标。　　 （2）体外培养人成骨细胞Saos-2，空白培养基为对照组，实验2.5、5、10、20、40、80mg/L NaF组为试验组，在24 h后以MTT法和Alamar Blue法测定氟作用下细胞的增殖以及酶学方法测定氧化损伤（SOD，MDA）情况。提取成骨细胞RNA，采用荧光定量反转录聚合酶链反应（real-time RT-PCR）方法检测Runx2和Osterix mRNA及下游基因COL1A2的表达。用化学比色法测定碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性。实时定量PCR（Real-time PCR）测定成骨相关基因：骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）、骨钙素（osteocalcin，OC）、骨桥蛋白（osteopontin，OP）和Mcm3（minichromosone maintenance 3，Mcm3）的表达。以双标准曲线法计算基因表达的相对比值。　　 （3）原代培养成骨细胞，并设立空白组和衣霉素阳性对照组。24h后western blot检测成骨细胞内BIP、XBP-1、CHOP、PDI、Mcm3表达水平。　　 结果：　　 （1）暴露组、对照组人群Mcm3和TM9SF1 mRNA 表达均略高于对照人群，但差异无统计学意义（P＞0.05）。所测的肝肾功能指标在两组中差异未显示出统计学意义。　　 （2）与对照组相比，氟化钠浓度小于20mg/L时，对细胞均呈现出增殖作用。其中以10 mg/L（此时F-浓度约为4.52ppm）组的促增殖作用最强。当氟化钠浓度大于20mg/L时，对细胞以抑制作用为主。两种方法的结果相似。在受试时间内80 mg/L组成骨细胞SOD活性较对照组显著下降（P＜0.05）。总体上看，SOD活性在氟作用受试浓度下，变化的波动性不大。而2.5-80mg／L组MDA含量明显增加，从20mg/L组起差异有统计学意义；总体上看，从2.5mg／L NaF组起的成骨细胞MDA水平逐渐提高。　　 （3）成骨细胞在体外染氟培养24h后，Osterix的表达，与对照组相比较，呈现出低剂量促进表达，高剂量抑制表达的双向反应形式：在2.5mg/L时表达量呈上升水平，而后随NaF剂量增加，表达下降明显。当NaF剂量为2.5-5mg/L时成骨细胞内基因Runx2表达水平均有不同程度增加，随后逐渐下降，至5mg/L时为最低。Ⅰ型胶原表达方式呈现出双向反应：剂量为2.5mg/L时，表达上调；剂量为5～80mg/L时，表达下调。　　 （4）随着氟化钠浓度的增高，ALP的活性增加。在NaF剂量为2.5～5.0mg/L时Mcm3表达与对照组相比是下降的，在10mg/L时表达为对照组的21.3倍，但在20、40 mg/L时表达量又低于对照组；OC的表达从2.5 mg/L时开始随剂量上升而下调；BSP的表达试验组2.5～10 mg/L 时BSp较对照组表达明显上调，当作用剂量为20～40mg/L时BSP表达明显下降，仅略高于对照组；OP表达量在7个实验组中均高于对照组，基本上呈现出随剂量升高表达量下降，至40mg /L时表达量最低。　　 （5）各干预组PDI蛋白表达量与空白对照与比较差异未见统计学意义（P＞0.05），XBP-1在10mg/L氟化钠组起表达明显高于空白对照，并随氟剂量表达量增加。从2.5mg/L氟化钠组起骨细胞中的BIP/β-actin高于对照组（P＜0.05）；从10mg/L氟化钠起，各加氟组的CHOP／GAPDH比对照组高（P＜0.05）。Mcm3蛋白表达能够被衣霉素所下调，而在其它浓度的氟作用下均有不同程度的表达上调，但无明显剂量反应关系。　　 结论：　　 （1）氟暴露可以使患者外周血中Mcm3和TM9SF1 mRNA表达轻度上调，两种指标在两组调查人群中的差异无统计学意义。氟对暴露者肝、肾功能的影响需要选取更多的指标综合分析，需要进一步评价。　　 （2）NaF具有低剂量促进细胞增殖，高剂量抑制细胞增殖的双相作用。氟对成骨细胞可以造成氧化损伤。　　 （3）Mcm3表达不规律并不适合作为诊断及监测成骨细胞在过量氟作用下的生物标志。氟化钠可能通过影响各成骨相关基因的表达而促进成骨分化。　　 （4）氟可影响成骨细胞Runx2和Osterix mRNA表达，表达水平与染氟的剂量有关。Runx2和Osterix又可以调节COL1A2 mRNA表达。　　 （5）氟能够引起成骨细胞内质网应激，提高Mcm3的表达，二者无直接相关。本研究中Mcm3蛋白表达未见明显与染氟剂量间的反应关系，其生物标志物特性需要进一步研究证实。