论文部分内容阅读
背景:Dock2是鸟嘌呤核苷酸交换因子,介导GDP与GTP的交换来调节小G蛋白的激活,可以调控细胞骨架变化,从而影响免疫细胞迁移和功能。现有的研究显示Dock2缺陷会导致各种免疫细胞,特别是T细胞,数目和增殖的减少,但在生理条件下其如何影响T细胞的活化和分化并不清楚。目的:研究Dock2缺陷对T细胞活化和分化的影响。方法:1.从野生型（WT）、Dock2+/-和Dock2-/-小鼠中收集胸腺组织,并将其研磨成单细胞悬液,进行细胞计数,比较各基因型小鼠之间的细胞数目,并通过流式细胞术检测胸腺T细胞中CD4、CD8、CD25和CD44的表达情况。2.从WT、Dock2+/-和Dock2-/-小鼠中收集脾脏和肠系膜淋巴结（MLN）,并将其研磨成单细胞悬液,进行细胞计数,比较各基因型小鼠之间的细胞数目,通过流式细胞术检测CD19、CD11b、CD4和CD8的表达情况,并检测CD4+和CD8+T细胞上CD69和CD44的表达情况。3.从WT、Dock2+/-和Dock2-/-小鼠中收集脾脏和MLN,并将其研磨成单细胞悬液,进行细胞计数,用PMA/离子霉素/BFA混合液刺激细胞,然后用FIX and PERM Kit试剂盒处理细胞,通过流式细胞术检测T细胞内IFN-γ、IL-17a和IL-4的表达情况。结果:1.Dock2缺陷影响胸腺T细胞的发育和胸腺生成WT和Dock2+/-小鼠之间胸腺的器官大小和重量相当,与WT相比,Dock2-/-小鼠有着更小和更轻的胸腺,以及更少的胸腺细胞。胸腺T细胞发育经历双阴性（DN,CD4-CD8-）、双阳性（DP,CD4+CD8+）、单阳性（SP,包括CD4+CD8-和CD4-CD8+）阶段。其中DN细胞根据CD44和CD25的表达又分为CD44+CD25-（DN1）、CD44+CD25+（DN2）、CD44-CD25+（DN3）和CD44-CD25-（DN4）阶段。Dock2+/-小鼠的CD4/CD8表达谱与WT小鼠相似。与WT相比,Dock2-/-小鼠的胸腺的CD4-CD8-细胞百分比显著增加,但CD4-CD8-、CD4+CD8+、CD4+CD8-、CD4-CD8+细胞的数量均减少。与WT相比,Dock2+/-小鼠有更少的CD44-CD25+细胞,其余细胞的分布相似。与WT相比,Dock2-/-小鼠CD44-CD25+细胞百分比显著增加,但是有更少的CD44+CD25-、CD44-CD25+和CD44-CD25-细胞数量。这些结果表明,Dock2缺陷影响胸腺T细胞的早期发育。2.Dock2缺陷导致外周淋巴组织中淋巴细胞减少与WT相比,Dock2+/-小鼠有更大和更重的脾脏,但WT和Dock2+/-小鼠之间MLN的器官大小和重量相当。WT和Dock2-/-小鼠之间脾脏和MLN的器官大小和重量相当。但是,Dock2-/-小鼠脾脏和MLN的细胞数目比WT小鼠的更少。在脾脏中,WT和Dock2+/-小鼠之间的CD8+T细胞、CD19+B细胞和CD11b+髓系细胞数量没有差别,但与WT相比,Dock2+/-小鼠的CD4+T细胞数目减少,提示部分敲除Dock2可以影响脾脏CD4+T细胞数量。在MLN中,WT和Dock2+/-小鼠有着相似的CD4+、CD8+T细胞、CD19+B细胞和CD11b+髓系细胞的比例。与WT相比,Dock2-/-小鼠的脾脏和MLN有更少的CD4+、CD8+T细胞和CD19+B细胞。这些结果表明,Dock2缺陷导致外周淋巴组织中T和B细胞减少。3.Dock2缺陷导致外周淋巴组织的T细胞呈现过度活化表型在脾脏中,WT和Dock2+/-小鼠的CD4+和CD8+T细胞上CD69的表达没有明显差别;在CD4+T细胞中,WT和Dock2-/-小鼠的CD69+细胞的百分比没有明显区别。在CD8+T细胞中,与WT相比,Dock2-/-小鼠有更高的CD69+细胞的百分比。与WT相比,Dock2+/-和Dock2-/-小鼠脾脏T细胞的CD44+细胞百分比均明显增加,提示活化表型。在MLN中,WT和Dock2+/-小鼠之间的CD69和CD44表达没有明显差异;与WT相比,Dock2-/-小鼠CD4+T细胞上CD69+和CD44+细胞的百分比明显上升。在CD8+T细胞中,Dock2-/-小鼠的CD44+细胞百分比明显高于比WT小鼠。这些结果表明,Dock2缺陷导致外周淋巴组织的T细胞表现为过度活化表型。4.Dock2缺失与外周淋巴组织中IFN-γ+细胞百分比增加有关在脾脏和MLN中,WT和Dock2+/-小鼠之间CD4+和CD8+T细胞的IFN-γ+细胞百分比没有明显差异;与WT相比,Dock2-/-小鼠CD4+和CD8+T细胞的IFN-γ+细胞百分比均明显增加。这些结果表明,Dock2缺失导致外周淋巴组织中CD4+和CD8+T细胞的IFN-γ+细胞百分比增加。5.Dock2缺失与外周淋巴组织中IL-17a+细胞百分比增加有关在脾脏和MLN中,WT和Dock2+/-小鼠之间CD4+和CD8+T细胞的IL-17a+细胞百分比没有明显差异;在脾脏中,WT和Dock2-/-小鼠CD4+T细胞的IL-17a+细胞百分比没有差异;与WT相比,Dock2-/-小鼠CD8+T细胞中IL-17a+细胞的百分比明显升高。在MLN中,与WT相比,Dock2-/-小鼠CD4+和CD8+T细胞的IL-17a+细胞百分比明显上调。这些结果表明,Dock2缺失导致脾脏CD8+T细胞中IL-17a+细胞的百分比增加,也可能导致MLN中CD4+和CD8+T细胞中IL-17a+细胞的百分比增加。6.Dock2缺失与MLN中CD8+T细胞的IL-4+细胞百分比增加有关在脾脏和MLN中,WT和Dock2+/-小鼠之间CD4+和CD8+T细胞的IL-4+细胞百分比没有明显差异;在脾脏中,WT和Dock2-/-小鼠之间CD4+和CD8+T细胞的IL-4+细胞百分比没有明显区别;在MLN中,WT和Dock2-/-小鼠CD4+T细胞的IL-4+细胞百分比没有明显差异;但是与WT相比,Dock2-/-小鼠的CD8+T细胞有更高比例的IL-4+细胞。这些结果表明,Dock2缺失导致MLN中CD8+T细胞中IL-4+细胞的百分比增加。结论:1.与WT小鼠相比,Dock2-/-小鼠脾脏中CD8+T细胞的CD69+细胞百分比显著增加,且Dock2-/-小鼠脾脏CD4+和CD8+T细胞的CD44+细胞百分比显著增加。2.与WT小鼠相比,Dock2-/-小鼠MLN中CD4+T细胞的CD69+细胞百分比增加,且Dock2-/-小鼠MLN CD4+和CD8+T细胞的CD44+细胞百分比显著增加。3.与WT小鼠相比,Dock2-/-小鼠的脾脏和MLN中CD4+和CD8+T细胞的IFN-γ+细胞百分比显著增加。4.与WT小鼠相比,Dock2-/-小鼠的脾脏CD8+T细胞和MLN中CD4+和CD8+T细胞中IL-17a+细胞的百分比显著增加。5.与WT小鼠相比,Dock2-/-小鼠MLN CD8+T细胞中IL-4+细胞的百分比增加。这些结果显示Dock2缺陷会导致外周淋巴组织的T细胞过度活化,并有更高比例的IFN-γ+和IL-17a+细胞,可能促进Th1细胞反应和Th17细胞反应。