偶氮染料广泛应用于纺织、印染和食品等工业,因结构特殊难以治理,其排放的大量废水对环境造成了严重的污染。传统的物化处置方法成本较高、易造成二次污染,而生物法因具有反应条件温和、对环境友好且不易二次污染等优势,成为了近年来的研究热点。本研究前期从印染厂附近的泥土中筛选出一株可降解偶氮染料的菌株,通过测序分析发现该菌株来源于厌氧芽孢杆菌属,并将其命名为厌氧芽孢杆菌PDR2。研究发现,该菌株拥有两种偶氮还原酶基因,而偶氮还原酶在偶氮染料的降解中发挥着极为重要的作用,为此本项目针对该菌株的两种偶氮还原酶展开了深入的研究。通过响应面优化法确定了菌株PDR2高产偶氮还原酶的最优培养条件,进一步通过蛋白的分离纯化、原核表达等技术获得细胞内的偶氮还原酶,并对其酶学性质进行深入的分析;为了更深入地了解偶氮还原酶降解染料的催化机制,通过同源建模、AutoDock对接以及活性位点预测等方法分析了偶氮还原酶与FMN、NADH和偶氮染料之间的结合模式和作用位点,并推测其可能存在的作用方式。研究结果如下:(1)通过全基因组测序分析发现Anoxybacillus sp.PDR2含有两种偶氮还原酶基因——NADH-flavin oxidoreductase 和 NADH oxidoreductase,将其分别命名为FMN和AZO,分析发现两者不具亲缘关系,但蛋白结构均属于α/β型结构。两种偶氮还原酶参与核黄素代谢通路,以NAD+或NADH为受体,参与菌株降解偶氮染料。(2)为了分离纯化出具有活性的偶氮还原酶,本研究采用响应面法优化菌株产酶培养基和培养条件,确定其最佳的产酶培养基为:葡萄糖5.43 g/L,牛肉膏+蛋白胨5.82 g/L,磷酸二氢钠3.5 g/L,磷酸二氢钾1.8 g/L,硫酸镁0.2g/L,硫酸锰0.02 g/L,三氯化铁0.02 g/L;最优培养条件为53.52℃下,pH 7.2,染料浓度为190.41 mg/L。经优化后,在最优条件下发现偶氮还原酶的酶活(634.20 U)相对原始未优化条件下的酶活(443.01 U)提高了 43.16%;在此最优培养条件下,采用蛋白分离纯化技术,成功纯化获得了其中一种具有活性的偶氮还原酶,并验证其为偶氮还原酶FMN。(3)利用原核表达技术成功表达出了菌株中的两种偶氮还原酶,通过优化两种偶氮还原酶重组菌的诱导表达条件,发现AZO重组菌最佳诱导条件为:添加诱导剂时菌体量OD600为0.8、诱导剂IPTG浓度为0.2 mmol/L、诱导时间24 h及诱导温度16℃,此时胞内重组酶降解甲基红的比酶活可达到15.65 U/mg;FMN重组菌最佳诱导条件为:添加诱导剂时菌体量OD600为0.8、诱导剂IPTG浓度为0.4mmol/L、诱导时间10 h及诱导温度20℃,此时胞内重组酶降解甲基红的比酶活可达到18.66 U/mg。在最优诱导表达条件下,通过Ni柱亲和层析分离纯化出了两种偶氮还原酶,且检测出了轻微的活性。(4)利用分子对接技术研究两种偶氮还原酶与不同结构偶氮染料的结合模式,结果表明:两种偶氮还原酶对结构简单的甲基红具有较高亲和力,其次对刚果红和直接黑G表现出较好的结合能力。通过分析软件对偶氮还原酶的关键活性位点进行分析,结果表明:偶氮还原酶FMN中的Asn104、Phe102、Ala121、Phe105可能起到至关重要的作用;偶氮还原酶AZO的Tyr74、Gly106、His75起着重要作用。本研究首次从具有偶氮染料降解能力的Anoxybacillus sp.PDR2中获取了两种具有降解活性的偶氮还原酶,并通过利用生物信息学分析、分子对接预测和活性位点分析方法对两种偶氮还原酶的结构特性和活性位点进行深入研究。该研究不仅可为“新型高效超级降解菌”的构建提供优良基因,也可为嗜热偶氮还原酶的作用机制解析提供新思路。此外,本研究首次从在嗜热环境中降解偶氮染料的菌株中获得了两种偶氮还原酶并解析了其对底物的对接机制,该研究可为偶氮染料废水的高效治理奠定一定的研究基础,同时为偶氮染料高效生物降解的产业化应用提供技术支撑,另外亦可为其它偶氮染料降解酶作用机制的深入研究提供一定的参考。