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研究目的:通过60Coγ射线全胸辐照DNA-PKcs基因敲除鼠探究DNA-PKcs在放射性肺纤维化（radiation-induced pulmonary fibrosis,RIPF）中的作用及分子机制。与此同时对RIPF小鼠进行化学药物干预或基因治疗,筛选和验证RIPF潜在的治疗靶标,为RIPF的防护和治疗提供重要理论依据。研究方法:（1）通过Cas9/sg RNA技术构建DNA-PKcs基因敲除鼠（DPK-/-）进行20Gy全胸照射,1个月后通过肺组织mRNA测序筛选差异表达基因,并利用生物信息学进行功能分析。（2）照射后1个月和5个月收集肺组织,qPCR检测肺组织中炎症因子改变,H＆E和Masson染色比较DNA-PKcs缺失对于辐射诱导肺组织病理改变过程中的作用。（3）通过肺组织切片免疫荧光和组织Western blot检测SPC、a-SMA、E-cadherin、N-cadherin和Twist等上皮间质转化（Epithelial mesenchymal transformation,EMT）相关蛋白表达。（4）通过慢病毒体系构建DNAPKcs稳定敲低肺上皮细胞细胞系（A549 shDPK）,使用放线菌酮检测DNA-PKcs缺失对Twist半衰期的影响。构建点突变质粒,通过免疫共沉淀探究DNA-PKcs与Twist之间的相互作用关系。（5）体外实验探究AKT1活性在DNA-PKcs调控Twist中发挥的作用,并在肺组织中验证AKT1活性及Twist表达之间的相关性。（6）在小鼠进行全胸照射前通过灌胃的方式给于DNA-PKcs靶向药物VND3207进行干预,通过H＆E和Masson染色观察VND3207对辐射引起的肺组织病理改变的作用。（7）通过免疫荧光检测肺组织和/或A549细胞中DNA-PKcs的磷酸化活性及g-H2AX的焦点形成。通过克隆形成试验、EDU+试验和细胞凋亡检测等检测VND3207是否通过靶向DNA-PKcs缓解辐射导致的细胞损伤。（8）检测VND3207是否通过靶向DNA-PKcs/AKT1/Twist缓解辐射导致的EMT。（9）在体外验证辐射响应miR-486-3p在辐射诱导EMT中的作用及机制。（10）通过腺相关病毒（AAV）搭载miRNA模拟物研究miR-486-3p在放射性肺纤维化中的潜在防治作用。研究结果:（1）肺组织mRNA测序结果显示,DNA-PK缺失导致的差异表达蛋白涉及细胞代谢、应激反应以及细胞黏附功能等,并富集在PI3K/AKT1、HIF-a等EMT相关信号通路上。（2）病理染色结果显示DNA-PKcs缺失会导致辐照后肺部炎症加剧,出现明显地肺间隔断裂、增厚,肺泡腔异常扩大、胶原纤维渗出增多。（3）在DNA-PKcs缺失的小鼠肺组织中发生了高度EMT,体内外实验结果显示,DNA-PKcs缺失促进了Twist表达,提示DNA-PKcs通过调控Twist参与辐射诱导的EMT过程。（4）DNA-PKcs缺失抑制了Twist上SQ/TQ位点磷酸化水平,但这些位点突变并不影响DNA-PKcs与Twist之间的相互作用,提示可能存在其他蛋白调控两者间的相互作用。（5）DNA-PKcs缺失抑制AKT1活性,且减少AKT1与Twist间相互作用。AKT1选择性激动剂IGF-1可逆转由DNA-PKcs缺失引起的Twist高表达和EMT相关蛋白改变。（6）与单纯照射组相比,VND3207干预组小鼠照射后肺部炎性浸润少,肺泡腔结构相对完整,可见少量胶原纤维渗出。（7）VND3207可在体内外增加辐照后肺组织和A549细胞中DNA-PKcs的自磷酸化活性,促进DNA损伤修复,促进细胞增殖,具有一定的抗凋亡和抗焦亡作用。（8）VND3207通过DNA-PKcs激活AKT1,促进E-cadherin和Twist的表达。（9）辐射抑制A549细胞中miR-486-3p表达,增加Snail表达,从而促进EMT。（10）体内过表达miR-486-3p可有效缓解辐射引起的肺部炎性浸润、肺间隔断裂增厚以及胶原纤维的渗出。结论:1、DNA-PKcs缺失会加剧放射性肺损伤及纤维化。2、DNA-PKcs/AKT1/Twist轴介导电离辐射诱导的肺EMT,参与RIPF发生发展。3、VND3207在体内外激活DNA-PKcs Ser2056位点自磷酸化活性,减少DNA双链断裂,并通过DNA-PKcs促进肺上皮细胞的增殖能力、抗凋亡能力和抗焦亡能力,缓解放射性肺损伤。4、VND3207可通过DNA-PKcs/AKT1/Twist轴抑制电离辐射诱导肺上皮细胞发生EMT,有效缓解RIPF的发生发展。5、辐射响应的miR-486-3p可靶向Snail抑制电离辐射诱导的肺EMT;由腺相关病毒（AAV）携带miR-486-3p模拟物在肺组织过表达可有效缓解RIPF。