论文部分内容阅读
附子,又名乌头或附片,附子是毛茛科植物乌头根的子根,具强心、镇痛、抗炎、降低血糖、局部麻醉的作用并且能够抗肿瘤、抗衰老和回阳救逆。主要化学成分有乌头碱、中乌头碱、次乌头碱、去氧乌头碱、塔拉乌头胺等。附子采用块根繁殖,这种无性繁殖方式能积累病虫害,导致产量下降和品质退化。附子受病虫害并造成了很多疾病包括:白绢病、白粉病、根结线虫病、花叶病等,同时连作障碍使附子病害不断积累,使附子品种退化并且严重影响正常生长,极大地限制了附子的种植生产。近年来在乌头道地产区江油常发生乌头花叶病毒病害,发生较高的年份或田块发病率最高可达70%80%。本研究通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）从分子方面鉴定附子地道产区四川江油乌头花叶病植株的病原物种类及其特性,并分析了病毒在不同部位的表达量差异,为乌头花叶病的防治奠定理论基础,具体研究结果如下:1.花叶病乌头中黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）外壳蛋白基因（CP）的克隆及序列比对分析根据GenBank中己收录的CMV的外壳蛋白基因的一段长度为375bp的保守序列设计特异引物:CMV（cp-F、R）,以花叶病乌头植株叶片和须根RNA反转录的cDNA作为底物,阴性对照选取健康的组培乌头叶片进行RT-PCR扩增。优化克隆条件,退火温度为55.7℃为得到的最优的克隆条件。经纯化、转化、测序得到一段长度为375bp核苷酸序列。与国内外已报道的18种代表性CMV分离物cp基因的核苷酸与氨基酸的序列相似性为74.8%-98.2%,73.4%-99.2%,与CMV亚组II的核苷酸相似性96.1%-98.2%,与CMV亚组II的氨基酸相似性为96.0%-99.2%,CMV分离物与中国分离物（CMV-PCT2）氨基酸序列相似性最高达到99.2%。遗传进化分析显示与中国分离物（Zin和Hubei-1）和美国分离物（DKRD）亲缘关系较近,聚在CMV亚组II分支,将其命名为CMV-FZ。3、花叶病乌头中CMV外壳蛋白基因的理化性质分析蛋白的理化性质预测分析,推测其分子式为C610H1004N186O183S3,相对分子量13952Da,等电点（PI）为10.77。该蛋白的不稳定系数为62.80,属于不稳定蛋白。脂肪系数为71.76,亲水性系数为-0.650。CMV-FZ基因编码125个氨基酸,比较蛋白的氨基酸组成,最多的两种氨基酸分别是Ser（丝氨酸）、Arg（精氨酸）,所占比例分别是12.0%、11.2%,氨基酸残基（Asp+Glu）带负电荷的为10个,氨基酸残基（Arg+Lys）带正电荷的为23个。疏水性预测表明CMV-FZ基因是亲水蛋白。预测蛋白质序列CMV-FZ亚细胞定位于叶绿体转运肽和细胞核中,跨膜区预测该蛋白为非跨膜蛋白,信号肽预测该蛋白可能在跨膜运输中起信号识别作用,成熟肽始于第17位氨基酸,含有信号肽序列为ALMDKSESTNASRTSRR。剪切位点位于第17-18位氨基酸。3、花叶病乌头中CMV外壳蛋白基因的蛋白质结构预测及motif预测CMV-FZ基因所编码蛋白质的二级结构预测分析结果显示,蛋白二级结构中有有5个β（Strand,e）折叠含量为17.1%,一个α螺旋（Helix,h）含量为15.4%,无规则卷曲（Coil,c）含量最高为67.5%。对CMV-FZ进行蛋白三级结构预测,预测结果与已报到1f15.1蛋白相似度很高,1f15.1是黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus CMV）（STRAIN FNY）。分别对CMV-FZ和其它4个CMV分离物和PSV的cp蛋白序列进行保守基序分析。结果显示这些CMV氨基酸序列均含有高度保守的motif 1-motif 6核心保守基序。CMV-FZ蛋白与亚组II CMV-Wem和Hubei-1蛋白的保守基序几乎完全相同。进一步说明CMV-FZ属于CMV亚组II。4、荧光定量检测CMV病毒在乌头不同部位的表达量用内参基因EF1、ACTIN相关引物克隆样本cDNA经测序根据基因比对分析,EF1与NCBI中的EF1基因（FJ389748.1）的相似度为93%,且在乌头块根、须根、叶中表达相对稳定。EF1基因相对保守,挑选EF1基因作为乌头内参基因。对花叶病乌头的叶、块根、须根进行实时荧光定量检测,分析CMV-FZ基因在乌头各部位表达量的差异,结果表明CMV病毒在叶片、须根和块根的表达量呈显著性差异,其中在叶片的表达含量最高,须根第二,块根最少。综上所述,通过对附子地道产区四川江油的乌头花叶病植株病原物种类进行分子鉴定并对基因序列分析其特性,结果表明黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus CMV）侵染花叶病症状的乌头。从分子上对乌头花叶病病原物进行了鉴定及序列分析,得到了一个关于乌头中黄瓜花叶病毒的鉴定体系,为其综合防治提供科学依据。