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生物药剂分类系统(BCS)是基于药物溶解性和渗透性测定的药物分类预测系统,目前被FDA、WHO、EMA等权威机构认可并应用于人用药物豁免其体内生物等效性研究,在药物研发过程中起到重要作用。鉴于兽药研发成本及利润等问题将BCS概念应用于兽药制剂研发领域,势在必行,但是人与动物在解剖、生理学等方面以及在临床使用的药物种类上均存在较大差异,故不能进行直接的种间外推,尚待深入研究以解决局限性和方法问题才能付诸应用。渗透性测定是BCS分类系统的重要步骤,FDA已有采用Caco-2细胞和MDCK-hMDR1细胞作为体外模型进行人用药物渗透性测定方法的指南,并根据测定的药物渗透性将药物进行BCS分类,进一步指导药物的研发过程。研究发现,Caco-2细胞中过表达人ABC转运蛋白P-糖蛋白(P-gp)和乳腺癌耐药蛋白(BCRP),但不同种属动物的P-gp和BCRP与人具有显著的差异,底物谱也具有一定差异,故采用Caco-2细胞进行鸡用药物渗透性测定可能会产生一定影响。本实验拟采用单独过表达和同时过表达鸡P-gp和BCRP的MDCK细胞测定4种抗菌药物的渗透性,并对测定结果进行差异比较,拟探讨MDCK过表达细胞系作为体外细胞模型测定鸡用药物的渗透性的可能性。该研究结果可为禽用药物渗透性测定的体外方法的建立奠定基础,为新兽药的开发以及更好地指导兽医临床用药提供参考,故具有重要的理论意义和实用价值。为探讨P-gp、BCRP过表达细胞系对抗菌药渗透性测定的影响。我们运用本实验室构建的 MDCK-chAbcb1、MDCK-chAbcg2 和 MDCK-chAbcb1/Abcg2 过表达细胞系以及野生型MDCK细胞对4种药物的渗透性进行了测定。首先,我们在Transwell TM单层膜上建立了 4种细胞的致密单层细胞模型,通过电阻测定验证细胞膜的完整性,结果显示4种细胞培养6 d后其跨膜电阻值均大于1 000 Ω,符合转运实验单层细胞模型致密程度需求。然后通过MTT法检测了 4种药物对细胞的安全浓度,以保证工作浓度下药物对单层细胞模型的完整性不造成影响,并优化了 4种药物的高效液相检测方法。最后采用双相转运实验测定了 4种抗菌药物的表观渗透性(Papp)并计算各转运蛋白对4种抗菌药物的净外排率(NER),根据NER≥2确定药物为转运蛋白底物。结果显示4种测定药物中,四环素为鸡BCRP和P-gp的共同底物(P-gp:NER50 μM=13.94、NER100 μM=8.77;BCRP:NER 50 μM=2.23、NER100 μM=2.74),磺胺间甲氧嘧啶钠为鸡P-gp的底物(NER50 μM=2.24;NER100 μM=2.33)。四环素在双表达细胞系中的净外排率为NER50μM=8.94;NER100μM=9.12。而磺胺氯吡嗪钠和磺胺二甲嘧啶不是两种转运蛋白的底物。进一步将四种药物在MDCK和三种过表达转运蛋白的MDCK细胞测得的表观渗透率(AP-BL侧)进行比较。结果显示50 μM和100μM的四环素在MDCK-chAbcg2细胞中测得的Papp与MDCK细胞相比,分别降低了 9.81倍和3.47倍;在MDCK-chAbcb1 细胞中的Papp分别降低了 13.95倍和3.07倍;在MDCK-chAbcb1/Abcg2细胞中的Papp分别降低了 22.08倍和13.87倍。磺胺间甲氧嘧啶钠50μM和100 μM时在MDCK-chAbcg2细胞中测得的Papp较MDCK测得的分别降低了 2.15倍和2.70倍;而在MDCK-Abcb1细胞中,50 μM时AP-BL的Papp未发生显著变化,100 μM时AP-BL的Papp降低了 1.45倍;在MDCK-Abcg2/Abcb1细胞中,50 μM和100 μM时AP-BL的Papp分别降低了 1.71倍和1.97倍。对于抗菌药磺胺氯吡嗪钠,相比于MDCK细胞中的实验结果,MDCK-chAbcg2细胞中,50 μM时AP到BL的Papp未发生显著变化,而100 μM时降低了 1.38 倍;MDCK-chAbcb1 中,50 μM 和 100 μM 时 AP-BL的Papp分别降低了1.98 倍和 1.78 倍;在 MDCK-chAbcb1/Abcg2 中,50 μM 和 100 μM时AP-BL 侧的Papp在分别降低了 2.49倍和2.58倍。对于抗菌药磺胺二甲嘧啶,相比于MDCK细胞中的实验结果,MDCK-chAbcg2细胞中,50 μM和100 μM时AP到BL的Papp分别升高了 1.52 倍和 2.16 倍;在 MDCK-chAbcb1 中,50 μM 时 AP-BL 侧的Papp降低了 1.41倍,而 100 μM时则升高了 2.98 倍;在 MDCK-chAbcb1/Abcg2,50 μM 时 AP-BL 侧表观渗透率未发生显著变化,而100μM时Papp升高1.91倍。综上所述,动物机体的外排泵转运蛋白对药物渗透性会产生影响,尤其在测定多种转运蛋白底物药物的渗透率时影响更显著,故在建立细胞模型进行药物渗透性测定时,建议考虑该因素的影响,最好能选择具有表达转运蛋白的细胞系进行测定,且药物浓度要能克服外排转运蛋白的作用,细胞模型的测定条件仍待进一步优化。