第一部分动物实验第一节Gd-EOB-DTPA增强MRI T1 mapping评价兔肝纤维化模型肝功能的实验研究目的:研究Gd-EOB-DTPA增强MRI T1mapping评价兔肝纤维化模型肝功能的价值。方法:广西医科大学实验中心提供的家兔80只,雌雄不限,体重2-3kg,年龄4-6个月。家兔饲养在层叠式不锈钢丝笼中。实验组兔腹腔注射40%的CCl4橄榄油溶液(国药集团化学试剂有限公司),剂量0.1ml/kg,前四周每周注射一次,四周以后每周注射两次。99%的分析乙醇(重庆川东化工有限公司)稀释成5%酒精溶液作为唯一饮水;对照组兔腹腔注射生理盐水,每周一次,剂量0.1ml/kg,饮用纯净水。分别于建模第6、8、10、12、14周取动物麻醉后行吲哚菁绿滞留实验,24小时后行MRI扫描及图像后处理。扫描结束后,经兔耳缘静脉注入空气将其处死,剖腹观察肝脏情况,并取大小约1.5mm3肝脏组织,送病理学检查,取材部位尽量与图像后处理时选取的感兴趣区域(region of interest,ROI)一致。动物麻醉首先给予肌肉注射10mg地西泮+0.5mg阿托品,麻醉后的动物在耳缘静脉穿刺前半小时给予戊巴比妥钠(重庆博艺化学试剂厂)麻醉,戊巴比妥钠粉剂溶于0.9%生理盐水,配成3%的戊巴比妥钠溶液,20mg/kg腹腔注射,实验中动物如果有清醒的迹象,重复注射20mg/kg的戊巴比妥钠。吲哚菁绿滞留实验采用DDG 300K肝功能分析仪(日本广电工业株式协会),取适量的注射用吲哚菁绿(丹东医创药业有限责任公司,25mg/支)溶于无菌盐水,配成2.5mg/ml的吲哚菁绿溶液,配置好的溶液仅限当时使用,麻醉好的动物侧卧,小腿剃毛后,将感光探头夹在皮肤薄且肌肉较丰富处,21G静脉留置针家兔耳缘穿刺置管成功后,经静脉管注射稀释好的吲哚菁绿溶液,总量0.5mg/kg,3秒钟内注射完成,DDG数据分析软件自动处理和分析数据并给出报告,计算吲哚菁绿15min的滞留率ICG R15。MR扫描采用Siemens Verio 3.0T MRI成像系统,16通道相控阵线圈,耳缘静脉注射肝胆特异性对比剂Gd-EOB-DTPA增强,浓度为0.25mol/l,总量0.025mmol/kg(0.1ml/kg),速率0.2ml/s,注射完成后以相同速率注射相同量生理盐水冲管。分别在增强前、增强后5min、10min和20min行T1 Mapping序列扫描,重复时间(repetition time,TR)4.8ms,回波时间(echo time,TE)1.4ms,扫描野(field of view,FOV)101X140mm,扫描矩阵59X128mm,层厚2mm,并行采集因子p=2,用T1-vibe抑脂序列两个不同反转角(5°和15°)扫描得到T1 mapping图像。扫描所得的图像传到西门子Syngo工作站测量肝脏T1弛豫时间,在T1 mapping图像上选取面积为0.5cm2的感兴趣区(region of interest,ROI),分别选取3个ROI测量,取平均值作为该肝段的T1弛豫时间值,根据测量结果计算T1弛豫时间减少率={(增强前T1弛豫时间—增强后T1弛豫时间)/增强前T1弛豫时间}X100%。病理学检查将取材标本置入100%的甲醛(重庆博艺化学试剂厂)和生理盐水稀释成10%甲醛溶液中固定24h,常规苏木素—伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色和Masson染色,观察肝小叶细胞变化和纤维化进展情况。并参照Yang等[46]报道的肝纤维化分期标准进行分期。S0期:无成纤维细胞增生,胶原纤维含量正常,无纤维化。S1期:有少量成纤维细胞增生,胶原纤维轻度增生,汇管区纤维化扩大,局限于窦周和小叶内纤维化。S2期:汇管区内成纤维细胞增生,胶原纤维呈较短的条状向小叶内延伸,汇管区周围纤维化,纤维间隔形成,小叶结构保留。S3期:汇管区内成纤维细胞大量增生,胶原纤维明显向小叶内延伸,形成纤维隔,纤维间隔伴小叶结构紊乱,无肝硬化。S4期:早期肝硬化。采用统计学软件SPSS 20.0进行数据处理和统计学分析,所有测量资料都用均数±标准差(X±S)表示。肝脏各段T1弛豫时间和T1弛豫时间减少率的差异采用单因素方差分析LSD法比较组间差异,p<0.05差异有统计学意义。HBP肝脏T1弛豫时间和吲哚菁绿滞留率R15(自变量)的关系采用一元线性回归分析,p<0.05差异有统计学意义。结果:动物成模数量:共34只动物成模并完成了全部实验,其中对照组5只,实验组29只,实验组按照肝脏纤维化程度不同,S1共7只,S2共7只,S3共8只,S4共7只。实验动物共80只,动物死亡情况分为:造模前饲养一周自然死亡4/80只(死亡率5%),造模中死亡29/76只(死亡率38.2%),预实验使用了8只动物,正式实验死亡5/39只(死亡率12.8%)。肝脏T1弛豫时间在增强后明显减少,随着时间延长,又逐渐有所升高(图2)。肝脏T1弛豫时间和弛豫时间减少率改变:各组动物肝脏T1弛豫时间在增强前差异无统计学意义(p>0.05),增强后2.5min、5min、10min、20min差异有统计学意义,各组两两比较,从2.5min开始,差异有意义的组数逐渐增多,20min时除了S1和S2组差异无统计学意义(p>0.05),其他组之间差异均有统计学意义(p<0.05)。增强后T1弛豫时间减少率在20min时除了S1和S2组差异无统计学意义(p>0.05),其他组之间差异有统计学意义(p<0.05)。增强后20min肝脏T1弛豫时间和吲哚菁绿滞留率ICG R15的相关性:T1弛豫时间和ICG R15两者显著正相关,Pearson相关系数0.608(p=0.001,t=3.309)。残差柱状分布图符合正态分布。增强后20min肝脏T1弛豫时间减少率和ICG R15的相关性:肝脏T1弛豫时间减少率和ICG R15两者显著负相关,Pearson相关系数0.739(p=0.000,t=-5.592)。残差柱状分布图基本符合正态分布。结论:1、不同肝纤维化组家兔肝脏的Gd-EOB-DTPA增强曲线表现不同。2、Gd-EOB-DTPA增强后20分钟肝脏T1弛豫时间(和T1弛豫时间减少率)与吲哚菁绿15分钟滞留率具有相关性。3、Gd-EOB-DTPA增强后延迟20分钟T1 mapping能有效评价家兔肝纤维化模型的肝脏功能。第二节Gd-EOB-DTPA增强MRI延迟10分钟和20分钟T1mapping评价兔肝纤维化模型肝功能的价值目的:对比研究肝特异性对比剂Gd-EOB-DTPA增强T1 mapping延迟10分钟和20分钟T1弛豫时间评价肝脏功能的价值。方法:同“动物实验第一节”结果:共34只动物成模并完成了全部实验,其中对照组(S0期)共5只,实验组29只,实验组按照肝脏纤维化程度不同,S1期共7只,S2期共7只,S3期共8只,S4期共7只(表1)。根据病理结果将实验组分成两组:轻度纤维化组(S1和S2)14例和重度纤维化组(S3和S4)(15例)。实验动物共80只,动物死亡情况分为:造模前饲养一周自然死亡4/80只(死亡率5%),造模中死亡29/76只(死亡率38.2%),预实验使用了8只动物,正式实验死亡5/39只(死亡率12.8%)。肝脏T1弛豫时间在Gd-EOB-DTPA增强后10min以及20min各组均有减少,正常组和轻度纤维化组可见明显减少,而重度纤维化组减少不明显。增强前各组肝脏T1弛豫时间差异无统计学意义(p>0.05),增强后10min、20min T1弛豫时间(和T1弛豫时间减少率)各组差异均有统计学意义(p<0.05)。增强后各组T1弛豫时间(以及T1弛豫时间减少率)在10min和20min这两个时间点之间的差异无统计学意义(p>0.05)。统计学一元线性回归分析结果显示:增强后10min、20min肝脏T1弛豫时间均和吲哚菁绿15min滞留实验ICG R15显著正相关,增强后10min的Pearson相关系数为R=0.493,修正后的R2=0.214(p=0.008,t=2.887),增强后20min的Pearson相关系数为0.608,修正后的R2=0.345(p=0.001,t=3.309)。增强后10min、20min肝脏T1弛豫时间减少率和ICG R15显著负相关,增强后10min的Pearson相关系数0.636,修正后的R2=0.381(p=0.000,t=-4.200)(图6a);增强后20min的Pearson相关系数0.739,修正后的R2=0.529(p=0.000,t=-5.592)。结论:对比Gd-EOB-DTPA增强后延迟10分钟和20分钟T1 mapping评价家兔肝纤维化模型的肝脏功能结果显示,延迟10分钟也能作为肝脏功能诊断的指标,达到定性和定量诊断的目的。第二部分临床研究 第一节Gd-EOB-DTPA增强MRI T1mapping在肝脏各段肝功能评价中的价值研究目的:研究肝特异性对比剂Gd-EOB-DTPA增强MRI T1 mapping对肝脏各段肝功能的诊断价值。方法:本研究为前瞻性研究,连续收集2015年3月至2016年12月广西医科大学第一附属医院和桂林医学院附属医院做了Gd-EOB-DTPA增强的患者,本研究经过单位伦理委员会批准,所有患者均在增强扫描前签署知情同意书。入组标准:(1)需要进行上腹部MRI增强扫描的成年患者;(2)MRI扫描前4周没有接受过射频治疗、化疗或者肿瘤栓塞治疗;(3)MRI扫描前、后一周内有体检以及临床生化检查能进行Child-Pugh分级;(4)没有胆道疾病导致的弥漫性肝脏病变,如原发性硬化性胆管炎,原发性胆汁性肝硬化等;(5)如果肝脏有局灶性病变,病变范围小于一个肝段;(6)没有MRI扫描和增强的禁忌症(例如:肝肾功能异常、植入不兼容设备如心脏起搏器等、幽闭恐惧症、孕妇及哺乳期女性)。共收集到符合要求的病例103例,其中男72例,女31例,年龄18~84岁(平均50.7±14.0岁)根据临床资料行Child-Pugh分级将患者分为四组:肝功能正常组(normal liver function,NLF)38例,其他有慢性肝炎或者肝功能异常的分为Child-Pugh A(liver cirrhosis with Child-Pugh A,LCA)组33例,Child-Pugh B(liver cirrhosis with Child-Pugh B,LCB)组21例,Child-Pugh C(liver cirrhosis with Child-Pugh B,LCB)组11例。Child-Pugh分级标准(表1):Child-Pugh A:5-6分;Child-Pugh B:7-9分;Child-Pugh C:10-15分MRI扫描:检查时运用腹带以减少呼吸干扰。扫描范围从膈顶至双肾下极,包及整个肝脏。MR扫描采用Siemens Verio 3.0T MRI成像系统,16通道相控阵线圈,肘前静脉注射肝胆特异性对比剂Gd-EOB-DTPA增强,浓度为0.25mol/l,总量0.025mmol/kg(0.1ml/kg),速率2ml/s,注射完成后以相同速率注射20ml生理盐水冲管。分别在增强前、增强后5min、10min和20min行T1 Mapping序列扫描,重复时间(repetition time,TR)4.8ms,回波时间(echo time,TE)1.4ms,扫描野(field of view,FOV)273X380mm,扫描矩阵161X320mm,层厚3mm,并行采集因子p=2,用T1-vibe抑脂序列两个不同反转角(5°和15°)扫描得到T1 mapping图像,图像传到西门子Syngo工作站测量肝脏T1弛豫时间,并计算T1弛豫时间减少率={(增强前T1弛豫时间-增强后T1弛豫时间)/增强前T1弛豫时间}X100%。扫描完成后所有图像传到西门子Syngo工作站,分别测量肝脏各段的T1弛豫时间,在T1 mapping图像上选取面积为2.5cm2的感兴趣区(region of interest,ROI),肝脏S1段选取一个ROI测量,其他肝段从肝脏边缘到肝门区分别选取3个ROI测量,取平均值作为该肝段的T1弛豫时间值。采用统计学软件SPSS 20.0进行数据处理和统计学分析,所有测量资料都用均数±标准差(X±S)表示。肝脏各段T1弛豫时间的差异采用单因素方差分析LSD法比较组间差异,p<0.05差异有统计学意义;LCB组和LCC组最佳诊断值的选取以及诊断价值分析采用受试者特征曲线(receiver operatingcharacteristic,ROC)分析,95%的可信区间,p<0.05差异有统计学意义。结果:各组患者在Gd-EOB-DTPA增强前后各肝段T1弛豫时间曲线:NLF组和LCA组从增强后5min开始一直到增强后20min,各肝段T1弛豫时间逐渐降低,到20min时各肝段之间的T1弛豫时间差异较小。LCB组增强后各肝段的T1弛豫时间在5min到20min差异不大,增强后20min各肝段T1弛豫时间差异较NLF组和LCA组增大。LCC组增强后各肝段的T1弛豫时间在5min最低,10min和20min又逐渐升高,且各肝段之间的差异在各组中最大。各组患者在Gd-EOB-DTPA增强前后各肝段的T1弛豫时间差异,平扫时各组T1弛豫时间差异无统计学意义(p>0.05)。增强后5min开始有部分肝段T1弛豫时间差异有统计学意义,到10min以后各段差异都有统计学意义(p<0.05)。两两比较发现,增强后10min LCC组各段和其他组差异有统计学意义(p<0.05),LCB组部分肝段差异有统计学意义(p<0.05);增强后20min,LCC组全部肝段和其他组的差异有统计学意义(p<0.05),LCB组和NLF组以及LCA组差异有统计学意义的肝段增多,但仍有部分肝段差异无统计学意义。ROC曲线分析结果显示:T1弛豫时间对LCB组的诊断价值,其中S6段的最高(AUC=0.904),S2段最低(AUC=0.654),采用T1弛豫时间来诊断的敏感性普遍高于特异性,其中S6和S8段的敏感性都达到了100%,特异性最高的是S5段,为83.6%。T1弛豫时间减少率对LCB组的诊断价值,其中S7段最高(AUC=0.904),S2段诊断最低(AUC=0.709),采用T1弛豫时间减少率来诊断的特异性普遍高于敏感性,其中S1和S6段的敏感性都达到了100%,特异性最高的是S7段,为98.6%。T1弛豫时间对LCC组的诊断价值,所有肝段的AUC都大于0.842。T1弛豫时间减少率对LCC组的诊断价值,所有肝段的AUC都大于0.887。结论:1、肝脏各段的T1弛豫时间在Gd-DOB-DTPA增强前后均有差异。2、对于LCB患者来说,T1弛豫时间在肝脏各段的诊断价值差异较大,S6和S7段的诊断价值最高,S2段最低。T1弛豫时间减少率的诊断价值总体较T1弛豫时间要高。3、对于LCC患者,T1弛豫时间和弛豫时间减少率都有很高的诊断价值,考虑到临床诊断的便利性,T1弛豫时间测量更适合临床应用。第二节对比研究Gd-EOB-DTPA增强MRI延迟10分钟和20分钟T1 mapping临床评价肝功能的价值目的:对比研究Gd-EOB-DTPA增强MRI T1 mapping扫描延迟10分钟和20分钟肝胆期评价肝功能的价值。方法:同“临床研究第一节”统计学分析:所有数据均采用统计学软件SPSS 20.0软件包分析。测量数据采用均数±标准差表示。各组的T1弛豫时间和T1弛豫时间减少率之间的差异采用多组数据的方差分析。不同时间点的T1弛豫时间和T1弛豫时间减少率对肝功能评价的诊断价值采用受试者特征曲线(Receiver operating characteristic,ROC)分析,曲线下面积(Area under the curve,AUC)、敏感性和特异性都根据95%可信区间计算得出,最佳诊断值(cut-off)由约登指数(Youden-Index)计算得到:敏感性+特异性-1。结果:不同肝功能各组T1弛豫时间和T1弛豫时间减少率:在Gd-EOB-DTPA增强前肝脏T1弛豫时间随着肝功能下降略有增加,增强后10min以及20min,实验各组T1弛豫时间均有减少,其中NLF组和LCA组可见明显减少,而LCB组和LCC组减少不明显。增强后10min和20min T1弛豫时间(和T1弛豫时间减少率)在各组的统计学差异:增强前各组肝脏T1弛豫时间差异无统计学意义(p>0.05),增强后10min、20min T1弛豫时间和T1弛豫时间减少率在NLF组和LCA组之间的差异无统计学意义(p>0.05),其余各组之间的差异均有统计学意义(p<0.05)。增强后各组T1弛豫时间以及T1弛豫时间减少率在10min和20min这两个时间点之间的差异无统计学意义(p>0.05)。增强后10min和20min T1 mapping对肝功能评价的诊断效能:ROC曲线分析分别计算增强后10min和20min T1弛豫时间以及T1弛豫时间减少率评价肝脏功能的曲线下面积、最佳诊断值、敏感性和特异性。增强后10min和20min T1弛豫时间和T1弛豫时间减少率都对LCB以及LCC组肝功能评价有较高的诊断效能,但是对区别NLF组和LCA组患者的诊断效能较低。结论:1、平扫T1弛豫时间无法有效评价肝脏功能。2、Gd-EOB-DTPA增强后延迟10min的T1 mapping图像也能有效评价临床肝脏功能,其诊断效能和延迟20min图像差异无统计学意义。