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华支睾吸虫病是由华支睾吸虫（Clonorchis sinensis）寄生在人及动物的肝脏胆管引起的一种重要的食源性人兽共患寄生虫病,与肝纤维化、肝硬化和胆管癌密切相关。在东亚地区,超过1500万人感染,我国约有1300万人感染,已被列为被忽视的热带病。华支睾吸虫感染者肝硬化发生率是未感染者的6倍以上,国际癌症研究机构将其列为I类致癌物。目前防控华支睾吸虫病主要是提倡不生食鱼虾和吡喹酮治疗,尚无有效疫苗,且尚无治疗或逆转华支睾吸虫导致肝纤维化的方法。深入认识华支睾吸虫致肝纤维化的致病机理将为华支睾吸虫病的防治新策略研发奠定基础,为寻找缓解华支睾吸虫性肝纤维化药物开发提供潜在靶点。TLRs作为一类重要的先天免疫模式识别受体,可以识别多种内源性和外源性病原相关分子模式,触发信号传导通路并诱导炎性细胞因子的释放。已报道TLR2、TLR3、TLR4和TLR9与肝纤维化有关。然而,对TLRs在华支睾吸虫致肝纤维化中的作用及其在机体抵抗华支睾吸虫感染中的具体机制尚缺乏详尽了解。针对这一科学问题,本研究首先开展了吉林省华支睾吸虫等鱼源性人兽共患吸虫（FZTs）流行情况调查;在建立华支睾吸虫致肝纤维化小鼠模型的基础上,探究TLR2和TLR3在华支睾吸虫致肝纤维化中的作用并解析二者调控下游信号通路和细胞因子表达的分子机制;同时对华支睾吸虫排泄/分泌蛋白（ESPs）及胞外囊泡（CSEVs）识别TLR2和TLR3作用进行研究;最后探讨以TLR3为靶标的Poly（I:C）治疗华支睾吸虫病效果。主要研究内容和结果如下:1、吉林省伊通河流域鱼源性人兽共患吸虫的流行情况调查鱼源性人兽共患吸虫是亚洲最严重的食源性寄生虫,其中包括主要流行于我国的华支睾吸虫。吉林省FZTs在中间宿主和终末宿主中的流行本底尚未摸清。本研究于2020年7月至11月,从吉林省伊通河流域采集了132只淡水螺、4122条野生淡水鱼和143份犬、鸭和猪粪便样品。通过形态学鉴定及生物信息学鉴定相结合,调查FZTs在各宿主中流行情况。结果显示,吉林省流行的FZTs种类为华支睾吸虫、东方次睾吸虫和日本棘隙吸虫。淡水鱼FZTs总流行率为29.74%（1226/4122）;淡水螺为2.27%（3/132）;犬为75%（21/28）;鸭为37.18%（29/78）。淡水鱼两种FZTs的共感染率为13.39%（552/4122）;犬为35.71%（10/28）;鸭为7.69%（6/78）。淡水鱼中三种吸虫的共感染率为2.60%（107/4122）。12种被检鱼类中,在9种鱼中检出FZTs囊蚴。2、华支睾吸虫感染致肝纤维化小鼠模型的建立（1）囊蚴最适感染数量筛选。以不同数量囊蚴分别感染C57BL/6 WT小鼠,通过监测小鼠的死亡率、计数肝内寄生虫数量,确定用于华支睾吸虫致肝纤维化C57BL/6小鼠模型建立的囊蚴数量。结果显示,最适的囊蚴感染数量为200个囊蚴/只鼠。（2）华支睾吸虫感染小鼠肝脏病变及损伤检测。对感染小鼠进行剖检,观察肝脏变化,病理切片观察小鼠肝脏炎症损伤及胆管病变。结果显示,华支睾吸虫感染引起胆囊肿大,胆汁淤积,肝脏结缔组织增生,肝内炎性细胞浸润,出现坏死灶,胆管细胞增生、变性、形成小胆管。（3）华支睾吸虫感染小鼠肝纤维化指标检测。RT-PCR检测肝脏TGF-β/Smad通路因子、肝纤维化标志蛋白α-SMA、I型胶原蛋白（Col1a）和III型胶原蛋白（Col III）的表达,马松染色检测肝内胶原沉积。结果显示,华支睾吸虫感染显著激活TGF-β/Smad通路因子,促进α-SMA、Col1a和Col III高表达,胆管周围胶原沉积持续积累,并在感染第35d后形成肝纤维化。3、TLR2信号通路在华支睾吸虫致肝纤维化中的作用机制建立华支睾吸虫感染TLR2-/-和WT小鼠肝纤维化模型,研究TLR2信号通路在华支睾吸虫致肝纤维化中的作用机制。（1）华支睾吸虫感染小鼠肝脏中TLRs激活情况。RT-PCR和免疫组化检测肝脏TLRs表达和胆管上皮细胞TLR2的表达。结果显示,华支睾吸虫感染WT小鼠肝脏中TLR2、TLR3、TLR4及TLR9表达升高;WT小鼠胆管上皮细胞（BECs）TLR2表达量显著升高。（2）TLR2对华支睾吸虫感染小鼠体重、生存和虫体数量影响。每日监测小鼠体重、死亡率,于感染后35 d计数肝内华支睾吸虫数量。结果显示,华支睾吸虫感染引起WT小鼠体重显著降低,死亡率约40%,肝内成虫数平均13条。TLR2缺失显著降低华支睾吸虫感染小鼠的死亡率（25%）,提高感染小鼠体重并降低肝内成虫数量（7条）。（3）TLR2对华支睾吸虫感染小鼠肝脏炎症及损伤的影响。病理切片及免疫组化分析肝脏损伤和炎症反应,ELISA检测细胞因子分泌。结果显示,华支睾吸虫感染导致WT小鼠肝脏病变明显,并引起肝内IL-6、TNF-α、IFN-γ和IL-4分泌量显著升高。TLR2缺失减轻华支睾吸虫感染小鼠肝损伤及胆管变性,降低IL-6、TNF-α及IL-4分泌。（4）TLR2对华支睾吸虫感染小鼠肝纤维化的影响。ELISA检测TGF-β1表达,Western blot检测Smad2/3磷酸化水平,免疫组化检测α-SMA和GFAP表达,马松染色检测肝脏胶原沉积。结果显示,与华支睾吸虫感染WT小鼠相比,TLR2缺失降低了小鼠TGF-β1的表达及Smad2/3磷酸化水平,减少α-SMA阳性肌成纤维细胞数量,缓解肝纤维化。并发现华支睾吸虫性肝纤维化中肌成纤维细胞主要来源于汇管区成纤维细胞。（5）华支睾吸虫分泌代谢产物（ESPs）激活BECs TLR2通路调控细胞因子表达。华支睾吸虫ESPs刺激小鼠BECs,Western blot检测AKT、p65、p38和ERK磷酸化水平,ELISA检测细胞因子分泌。结果显示,华支睾吸虫ESPs可激活BECs TLR2介导的AKT和p38通路,增加IL-6的产生。4、TLR3信号通路在华支睾吸虫致肝纤维化过程中的作用机制建立华支睾吸虫感染TLR3-/-及WT小鼠肝纤维化模型,研究TLR3信号通路在华支睾吸虫致肝纤维化中的作用机制。（1）TLR3对华支睾吸虫感染小鼠体重、生存、和虫体数量影响。每日监测体重、死亡率,于感染后35 d计数肝内虫体数量。结果显示,与WT小鼠相比,TLR3缺失小鼠死亡率显著升高、体重降低、肝内成虫数量增加。RT-PCR显示华支睾吸虫感染WT小鼠肝脏中TLR3表达显著升高。（2）TLR3对华支睾吸虫感染小鼠肝脏炎症及损伤的影响。病理切片及免疫组化分析肝脏损伤和炎症反应,ELISA检测细胞因子分泌。结果显示,与WT组相比,TLR3缺失加剧了华支睾吸虫感染小鼠肝损伤及胆管变性,IL-6、TNF-α及IL-4分泌增加,而IFN-γ分泌降低。（3）TLR3对华支睾吸虫感染小鼠肝纤维化的影响。ELISA检测TGF-β1表达,Western blot检测肝组织Smad2/3磷酸化水平,免疫组化检测α-SMA表达,马松染色检测肝脏胶原纤维沉积。结果显示,TLR3缺失小鼠TGF-β1的表达及Smad2/3磷酸化水平进一步升高,肌成纤维细胞数量增加,肝纤维化加剧。（4）华支睾吸虫ESPs、胞外囊泡（EVs）激活BECs TLR3调控IL-6分泌。华支睾吸虫ESPs或EVs刺激小鼠BECs,RT-PCR检测TLR3 m RNA水平,Western blot检测AKT、p65、p38、ERK磷酸化水平,ELISA检测细胞因子分泌情况。结果显示华支睾吸虫ESPs和EVs激活WT BECs的TLR3表达,促进p38及ERK磷酸化和IL-6及TNF-α分泌。TLR3缺失后p38及ERK磷酸化水平和IL-6及TNF-α分泌量进一步增加。斑点免疫试验结果表明ESPs和EVs中富含ds RNA。Poly（I:C）处理抑制ESPs或EVs诱导BECs的IL-6及TNF-α分泌。5、TLR3激动剂Poly（I:C）对华支睾吸虫致肝纤维化的影响建立华支睾吸虫感染WT小鼠肝纤维化模型,用Poly（I:C）处理感染小鼠。（1）Poly（I:C）处理对华支睾吸虫感染小鼠体重、死亡率、肝内虫体数量的影响。每日监测体重、死亡率,于感染后35 d计数肝内虫体数量。结果显示,Poly（I:C）处理感染小鼠体重显著增加,死亡完全被阻断,肝内虫体数量大幅减少。（2）Poly（I:C）处理对华支睾吸虫感染小鼠肝脏炎症及损伤的影响。ELISA检测肝内细胞因子分泌,病理切片及免疫组化分析肝脏损伤和炎症反应。结果显示,与未处理组相比,Poly（I:C）处理组IL-6、IL-4和TNF-α分泌量显著降低,而IFN-γ分泌量增加;肝脏炎症和胆管变性明显缓解。（3）Poly（I:C）处理对华支睾吸虫感染小鼠肝纤维化的影响。免疫组化检测α-SMA表达,马松染色检测肝脏胶原沉积。结果显示,Poly（I:C）处理显著减少肌成纤维细胞数量,缓解华支睾吸虫性肝纤维化。综上,本研究调查了吉林省伊通河流域华支睾吸虫及其他FZTs的流行情况,明确吉林省伊通河流域为华支睾吸虫、东方次睾吸虫及日本棘隙吸虫疫源地。首次探讨了TLR2和TLR3在华支睾吸虫性肝纤维化中的作用机制。一方面,华支睾吸虫感染通过TLR2介导的AKT和p38通路激活TGF-β1-Smad2/3、促进IL-6的分泌,导致肌成纤维细胞活化,加剧肝纤维化。另一方面,TLR3识别华支睾吸虫ESPs和EVs中ds RNA,通过调控p38及ERK的磷酸化减少IL-6及TNF-α分泌,降低肝脏炎症及损伤,进而减轻华支睾吸虫性肝纤维化。TLR3激动剂Poly（I:C）处理能够缓解华支睾吸虫性肝纤维化。此外,首次发现在华支睾吸虫致肝纤维化中,肝脏中肌成纤维细胞主要来源为汇管区成纤维细胞。通过以上研究,获得了吉林省华支睾吸虫及其他FZTs流行病学数据,揭示了TLR2和TLR3在华支睾吸虫感染致肝纤维化中的不同作用机制,提供治疗华支睾吸虫性肝纤维化候选药物。为进一步以TLRs为靶点开发华支睾吸虫病的防控策略提供科学依据。