研究目的:细菌性脑膜炎(Bacterial meningitis,BM),亦称化脓性脑膜炎(Purulent meningitis),指各种细菌侵入中枢神经系统引起脑实质、脑膜或血管的中枢神经系统感染性疾病。肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,SP)是目前细菌性脑膜炎最常见和最主要的致病菌之一,因其具有高致残、致死率的特点,对儿童健康造成了严重威胁。在SP性脑膜炎疾病进展过程中,存在血脑屏障破坏和脑神经元坏死、凋亡等改变,导致脑损伤。因此,进一步研究SP性脑膜炎脑损伤的发生发展机制,可为寻求该疾病新的治疗手段提供初步的实验和理论依据。在感染性疾病中,固有免疫是机体抵御病原体的第一道防线。髓样相关蛋白-8/14(Myeloid-related protein-8/14,MRP8/14)也被称 S100A8/A9,钙卫蛋白,是 S100 蛋白家族中的一员,是由移动抑制因子相关蛋白(migration inhibitory factor-related protein,MRP)8型和14型构成的异二聚体,是机体固有免疫通过Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)感知自身组织释放的内源性损伤相关分子模式(damage-associated molecular patters,DAMPs)的一种。MRP8/14最早被发现于中性粒细胞中的具有免疫原性的蛋白,属于钙结合蛋白S100家族成员,EF手型(EF-hand)结构为蛋白重要的功能结构域,可结合Ca2+使蛋白的构象发生改变,暴露出与靶蛋白相互作用的位点,从而发挥相应的生物学功能。MRP8/14的表达具有组织和细胞特异性,主要表达在髓样细胞(myeloid cells)内,在中性粒细胞内表达最多,占中性粒细胞胞浆可溶性成分的50%,在单核细胞内也有组成性表达。MRP8/14在炎症中具有可参与和促进炎症反应,诱导细胞凋亡等生物学功能。目前MRP8/14在SP性脑膜炎中的研究报道不多。SP性脑膜炎时存在过度强烈的炎症反应,同时介导脑损伤神经元凋亡。是否能将MRP8/14其作为一种新的治疗切入点,防治SP性脑膜炎脑损伤,是我们所关注的问题。本研究首先建立了小鼠SP性脑膜炎的模型,从SP小鼠行为学、脑水肿情况、脑组织匀浆中IgG、Albumin浓度水平及脑损伤标志物NSE、caspase3表达的改变等方面展开了研究,借以探讨MRP8/14对SP性脑膜炎小鼠脑损伤的影响,了解其在细菌性脑膜炎病情进展中的作用,以期为细菌性脑膜炎的治疗提供新的思路和实验依据。研究方法:1、研究MRP8/14对SP性脑膜炎小鼠神经行为学改变、体质量变化的影响,取月龄为1.5-2月的健康雄性BALB/C小鼠48只,随机分为4组:磷酸缓冲盐溶液对照组(PBS组)、MRP8/14蛋白组(MRP8/14组)、肺炎链球菌组(SP组)、肺炎链球菌+MRP8/14蛋白组(SP+MRP8/14组);每组12只小鼠。腹腔注射诱导麻醉后,通过侧脑室定位注入40ul磷酸缓冲盐溶液(PBS)+5ul SP混悬液来建立小鼠SP性脑膜炎模型;PBS组注射45ul磷酸缓冲盐溶液(PBS),MRP8/14组注入40ul MRP8/14蛋白+5ul磷酸缓冲盐溶液(PBS),SP组注入40ul磷酸缓冲盐溶液(PBS)+5ul SP混悬液,SP+MRP8/14 组注入 40ulMRP8/14 蛋白+5ul SP 混悬液。2、分别于侧脑室注射后6h、24h、48h对各组小鼠进行:1)神经行为学评分;2)记录体质量的变化(分别记录注射前后在不同时间点小鼠的体质量,分析前后体质量变化率);3)采用脑组织含水量(cerebral water content,CWC)测量法,参照Ellion公式计算:脑组织含水量(%)=(湿重-干重)/湿重X100%。记录脑水肿的变化(分别记录在不同时间点小鼠的脑组织重量,分析前后脑组织重差值、比率的变化)。3、分析MRP8/14对SP性脑膜炎小鼠血脑屏障及脑损伤的作用,采用ELISA法测定脑组织匀浆中IgG、Albumin浓度水平,免疫组化检测脑损伤标志物NSE,凋亡相关蛋白caspase3表达的影响。关于动物模型及分组同实验方法:分别于侧脑室注射后6h、24h、48h,对小鼠进行酶联免疫吸附测定(ELISA法)测定脑组织匀浆中IgG、Albumin水平,免疫组织化学方法检测脑组织中NSE、caspase3蛋白的表达。4、研究MRP8/14对SP性脑膜炎小鼠脑组织中神经元死亡(Nissl染色)的影响,评价脑损伤情况。关于动物模型及分组同实验方法:分别于侧脑室注射后6h、24h、48h,通过显微镜观察不同时间点小鼠脑组织中Nissl染色阳性细胞及其数量的改变,检测小鼠脑组织中神经元的丢失情况。研究结果:一、SP性脑膜炎小鼠模型的建立(一)MRP8/14对SP性脑膜炎小鼠临床症状的影响1、神经行为学评分:分别记录各组小鼠侧脑室注射后6h、24h、48h时的临床评分。MRP8/14 组与 PBS 组小鼠临床评分比较:6h(5.0±0)vs(5.0±0)、24h(4.75±0.5)vs(5.0±0)、48h(5.0±0)vs(5.0±0),差异均无统计学意义(P>0.05);SP 组在6h、24h、48h 临床评分较 PBS 组均明显降低:6h(4.75±0.5)vs(5.0±0)、24h(3.5±0.577)vs(5.0±0)、48h(3.25±0.957)vs(5.0±0),差异具有统计学意义(P<0.05);SP+MRP8/14组与 SP 组相比明显降低:6h(4.5±0.577)vs(4.75±0.5)、24h(2.5±0.577)vs(3.5±0.577)、48h(1±0.816)vs(3.25±0.957),差异具有统计学意义(P<0.05)。2、体质量减少率比较:分别记录各组小鼠侧脑室注射前和注射后6h、24h、48h体质量,并计算相应的变化率。MRP8/14组与PBS组小鼠在6h、24h、48h体质量减少率:6h(2.237±0.407)vs(2.152±0.403)、24h(4.458±1.784)vs(5.338±2.049)、48h(7.032±2.600)vs(5.683±2.480),两组间体质量变化无显著差异(P>0.05);SP组接种细菌后6h、24h、48h时体质量相对于PBS组均降低,体质量减少率增加:6h(2.7499±0.309)vs(2.152±0.403)、24h(9.125±0.365)vs(5.338±2.049)、48h(10.036±0.905)vs(5.683±2.480),差异均具有统计学意义(P<0.05);SP+MRP8/14组与SP组相比体质量明显降低,体质量减少率增加:6h(2.92±0.357)vs(2.749±0.309)、24h(11.336±1.454)vs(9.125±0.365)、48h(13.803±2.303)vs(10.036±0.905),差异均具有统计学意义(P<0.05)。(二)MRP8/14对SP性脑膜炎小鼠脑组织含水量比率的影响脑组织含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。实验结果显示,SP感染后6h、24h、48h,小鼠脑组织含水量呈增加的趋势。MRP8/14组与PBS组相比较:小鼠脑组织含水量比率无显著差异,6h(76.859±0.308)vs(77.076±0.756)%、24h(77.149±0.928)vs(76.047±0.744)%、48h(78.785±0.779)vs(76.998±0.832)%0 SP组在6h、24 h、48h脑组织含水量比率较PBS组均明显增加,6h(78.055±0.774)vs(77.076±0.756)%、24h(79.154±1.235)vs(76.047±0.744)%、48h(82.87±0.626)vs(76.998±0.832)%,差异具有统计学意义(P<0.05);SP+MRP8/14组与SP组小鼠脑组织含水量比率相比明显增加:6h(78.909±1.195)vs(78.055±0.774)%、24h(81.179±1.053)vs(79.154±1.235)%、48h(88.019±1.036)vs(82.87±0.626)%,差异具有统计学意义(P<0.05)。二、MRP8/14在小鼠SP性脑膜炎脑损伤中的作用(一)MRP8/14对SP性脑膜炎小鼠脑组织神经元丢失的影响Nissl染色结果:四组小鼠脑组织中均有Nissl染色阳性的细胞,在脑组织中,MRP8/14组Nissl染色阳性的神经细胞与PBS组比较无明显差异,6h(112±0.816)vs(113.25±2.362)、24h(109.5±1.290)vs(117±3.464)、48h(105.5±2.886)vs(115.25±2.986),差异无统计学意义(P>0.05);SP组与PBS组比较阳性细胞数量减少 6h(106±2.943)vs(113.25±2.362)、24h(94±1.825)vs(117±3.464)、48h(85.25±1.707)vs(115.25±2.986),差异具有统计学意义(P<0.05);在 6h、24h、48h三个时间点,SP+MRP8/14组阳性细胞数目均低于SP组6h(91.75±4.031)vs(106±2.943)、24h(80.75±5.560)vs(94±1.825)、48h(74.25±3.685)vs(85.25±1.707),差异有统计学意义(P<0.05)。(二)MRP8/14对SP性脑膜炎小鼠脑组织中血脑屏障通透性指标IgG、Albumin的影响1、SP感染后6h、24h、48h,小鼠脑组织中IgG的浓度呈增加的趋势,实验发现:MRP8/14组与PBS组小鼠脑组织中IgG浓度无显著差异,6h(56.010±14.336)vs(59.594±22.975)、24h(58.905±9.057)vs(71.025±21.050)、48h(49.972±7.450)vs(53.992±12.488);SP组在6h、24h、48h小鼠脑组织中IgG浓度较PBS组均明显增加,6h(218.548±50.900)vs(59.594±22.975)、24h(659.693±223.473)vs(71.025±21.050)、48h(1224.340±266.477)vs(53.992±12.488),差异具有统计学意义(P<0.01);SP+MRP8/14组小鼠在6h、24h、48h小鼠脑组织中IgG浓度均明显高于 SP 组,6h(288.155±67.407)vs(218.548±50.900)、24h(1461.726±26.531)vs(659.693±223.473)、48h(2680.163±307.636)vs(1224.340±266.477),差异具有统计学意义(P<0.01)。2、SP感染后6h、24h、48h,小鼠脑组织中Albumin浓度呈增加的趋势,实验发现:MRP8/14组与PBS组小鼠脑组织中Albumin浓度无显著差异,6h(10.208±3.567)vs(9.708±4.769)、24h(8.933±1.589)vs(13.109±2.672)、48h(10.265±1.898)vs(14.098±2.889),SP组在6h、24h、48h小鼠脑组织中Albumin浓度较PBS组均明显增加,6h(14.215±3.660)vs(9.708±4.769)、24h(18.021±1.292)vs(13.109±2.672)、48h(27.334±2.736)vs(14.098±2.889),差异具有统计学意义(P<0.01);SP+MRP8/14组小鼠在6h、24h、48h小鼠脑组织中Albumin浓度均明显高于SP组,6h(19.440±4.677)vs(14.215±3.660)、24h(25.322±3.153)vs(18.021±1.292)、48h(38.214±4.255)vs(27.334±2.736),差异具有统计学意义(P<0.05)。(三)MRP8/14对SP性脑膜炎小鼠脑组织中脑损伤标志物NSE、caspase3表达的影响脑组织免疫组织化学结果:1、脑组织中NSE蛋白的表达:在脑组织中,各组小鼠均有NSE 阳性细胞表达,光镜下为胞浆内有棕褐色颗粒沉积。我们发现在细菌注射后6h、24h、48h,MRP8/14组与PBS组比较NSE 阳性细胞数目无明显差异,6h(100±4.209)vs(100.63±3.543)、24h(100.25±3.240)vs(100.38±2.774)、48h(99.75±5.994)vs(99.5±2.563),差异无统计学意义,(P>0.05);SP组NSE 阳性细胞数较PBS组明显减少,6h(96.38±1.685)vs(100.63±3.543)、24h(86.25±2.252)vs(100.38±2.774)、48h(77.25±2.915)vs(99.5±2.563),差异有统计学意义(P<0.05)。SP+MRP8/14 组NSE 阳性细胞数明显少于 SP 组,6h(88.25±2.915)vs(96.3 8± 1.685)、24h(68.38±2.446)vs(86.25±2.252)、48h(56±4.690)vs(77.25±2.915),差异具有统计学意义(P<0.05)。2、脑组织中caspase3蛋白的表达:在脑组织中,各组小鼠均有caspase3 阳性细胞表达。MRP8/14组、PBS组6h、24h、48h均出现caspase3免疫组化反应阳性,但阳性细胞数无明显差异,6h(5.43±0.850)vs(6.25±0.957)、24h(6.75±2.062)vs(6.25±1.893)、48h(5.75±0.957)vs(8±2.160)(P>0.05),差异无统计学意义(P>0.05);SP 组 caspase3 表达较 PBS 组明显升高,6h(16.38±0.955)vs(6.25±0.957)、24h(21.75±2.754)vs(6.25±1.893)、48h(42.5±2.380)vs(8±2.160),差异均具有统计学意义(P<0.05);SP+MRP8/14 组 caspase3 表达均明显高于 SP 组,6h(21.29±2.525)vs(16.38±0.955)、24h(36.5±3.512)vs(21.75±2.754)、48h(63.25±1.259)vs(42.5±2.380),差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:1、本实验采用经侧脑室途径,注射SP混悬液,建立了小鼠SP性脑膜炎模型,SP感染后导致小鼠临床评分降低,体质量减轻,脑水肿加重,进一步表明小鼠SP性脑膜炎模型的成功建立。2、在SP性脑膜炎模型中,脑匀浆中血脑屏障通透性指标IgG、Albumin浓度增加,脑组织中脑损伤标志物分子NSE蛋白表达减少,caspase3蛋白表达增加,Nissl染色阳性的神经元细胞减少。上述实验结果表明,在SP性脑膜炎小鼠模型中,脑损伤显著存在。3、髓样相关蛋白MRP8/14加剧了 SP性脑膜炎小鼠的临床症状,促进了脑组织神经元丢失(Nissl染色阳性的神经细胞减少明显);同时脑匀浆中血脑屏障通透性指标IgG、Albumin浓度进一步增加。脑组织中NSE蛋白表达进一步减少,caspase3蛋白表达增加,以上结果表明MRP8/14加剧了 SP性脑膜炎小鼠的脑损伤。