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【目的】 我们实验室的前期研究已从湛江红树林内生真菌拟茎点霉素(Phomopsis sp.)次级代谢产物中分离得到细胞松弛素H(cytochalasin H, CyH)单体,本文继续深入探讨CyH对肺癌血管生成的影响及其潜在的分子机制,为将CyH发展为抗肺癌血管生成的潜在药物提供科学依据。 【方法】 体外血管生成分析:分别用CyH(0μmol/L、0.78 μmol/L、1.56 μmol/L、3.13 μmol/L、6.25 μmol/L)处理A549 和H460肺癌细胞24 h,收集各处理组的条件培养液,将其与人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)混合后接种到已聚合固化的 ECMatrixTM表面。以ECM 625 Matrigel作为基质检测CyH对肺癌细胞条件培养液诱导的HUVECs微管形成的影响。 体内血管生成分析:分别用CyH(0μmol/L、6.25μmol/L、12.5μmol/L、25 μmol/L)处理 A549 和 H460 肺癌细胞24 h,收集各处理组的细胞及其条件培养液,与BD Matrigel Matrix混合后注射入裸鼠腋侧皮下。10 d 后,处死小鼠,剥离出Matrigel,拍照后迅速将 Matrigel 切成两份,一份用于免疫组织化学分析,一份用于血红蛋白的测定。 分别用CyH(0μmol/L、6.25μmol/L、12.5μmol/L、25μmol/L)处理A549和H460肺癌细胞16 h,收集细胞及其条件培养液。采用蛋白质印迹法(Western blotting)检测细胞中缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)、p-AKT、p-70S6K和p-ERK1/2的蛋白表达情况,RT-qPCR分析HIF-1α、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的mRNA 表达变化,酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定各条件培养液中VEGF的蛋白浓度。 【结果】 1. 体外血管生成实验结果显示:溶剂对照组的条件培养液明显刺激了HUVECs的微管形成;当用CyH(0 μmol/L、0.78 μmol/L、1.56 μmol/L、3.13μmol/L、6.25μmol/L)处理A549和H460肺癌细胞后,HUVECs微管形成受到抑制,并且抑制作用随着CyH浓度的升高而增强,总管长度明显缩短(P<0.05)。 2. 体内血管生成实验结果显示:与溶剂对照组相比,CyH(6.25μmol/L、12.5μmol/L、25μmol/L)处理组的血管生成明显减少,且血红蛋白含量 (P<0.01)及HIF-1α和VEGF蛋白表达也明显降低。 3. Western blotting结果显示:CyH抑制了HIF-1α蛋白的表达,并且抑制作用随着CyH浓度的升高而增强。同时,用CyH处理A549和H460细胞后,p-AKT、p-P70S6K、p-ERK1/2的蛋白表达被抑制, 并且抑制作用随着 CyH 浓度的升高而增强。 4. RT-qPCR结果显示:CyH对A549和H460细胞中HIF-1α的mRNA 表达无明显影响。但是,CyH对A549和H460细胞中VEGF的mRNA 表达有明显的抑制作用(P<0.05)。 5. ELISA 结果显示:CyH抑制了A549 和H460细胞VEGF蛋白的分泌,并具有浓度依赖性。12.5 μmol/L、25 μmol/L CyH处理组与溶剂对照组相比, VEGF的蛋白分泌差异具有显著性(P<0.01)。 【结论】 CyH 可抑制 A549 和 H460 肺癌体内外血管生成,其机制可能与抑制HIF-1α 蛋白表达、VEGF蛋白分泌和VEGF mRNA表达以及抑制PI3K/AKT/P70S6K和ERK1/2信号通路的激活有关。