酶体外定向进化(in vitro directed enzyme evolution)是近几年发展起来的一项新技术,已广泛成功用于酶的体外定向改良。目前用于该领域的技术主要是易错PCR和基于同源重组的DNA Shuffling,其核心都是基于PCR过程的体外诱变最终实现分子的多样性,程序的复杂性使应用受到一定限制。为使这一技术更加简单易行,试图通过降低Taq DNA聚合酶的保真度,使其适合于PCR程序的直接基因诱变。本研究根据Taq DNA聚合酶结构与功能信息以及前人对该酶的研究基础,对Taq DNA聚合酶基因进行了定点诱变和保真度研究,并利用构建的低保真Taq DNA聚合酶对人们关注的纤维素酶进行了体外进化,取得以下结果:1、通过长引物扩增策略将Taq DNA聚合酶的661位点密码子GCG变为CAC,导致661的缬氨酸变为组氨酸,获得突变体Taq-V661H。并用GFP作为模板通过PCR产物的克隆和序列测定分析了该突变体的保真度。结果表明,Taq-V661H的总突变率为0.122%,突变频率比野生型提高6倍。有意思的是,95%的碱基突变发生在AT碱基。其中,A变为G占总突变频率的48%。这一现象揭示了V661H位点不仅降低了TaqDNA聚合酶的保真度而且与碱基突变选择性有关。这一新的发现不仅为酶蛋白结构和功能关系的研究提供了新的信息,也为其进一步应用奠定了基础。2、通过定点诱变将666位密码子CAA变为CGC,导致谷氨酰胺变为精氨酸,获得突变体Taq-N666R。同样利用GFP作为模板分析了Taq-N666R的保真度,结果表明,总突变频率为0.042%,发现该突变株对不同碱基之间突变频率也有明显差异,其中,T变为C占总突变频率的42%。这一突变特性为进一步研究Taq DNA聚合酶的碱基突变选择性提供了新的线索。3、同样方法通过定点诱变技术将Taq DNA聚合酶的664位点的ACC密码子变为CGC,使苏氨酸变为精氨酸,获得了突变体Taq-T664R。使用该突变酶进行PCR扩增,分析了Taq-T664R对GFP基因碱基突变频率的影响,结果表明,碱基总突变率为0.99%,突变频率比野生型增加了99倍,发现A和T转换为其它碱基的比率占95%,而T转换为C和A转换为G的频率分别占18%和42%。在蛋白质水平上,氨基酸突变率为2.3%,碱基的定向富集导致带电荷氨基酸大幅度增加,这一现象可能对热稳定性酶的体外进化有着重要的意义。4、为了验证低保真度酶Taq-T664R在体外分子进化的实用性,本研究选择在木质纤维素降解过程中起关键作用的纤维素内切酶作为目标分子,利用突变体Taq-T664R对该酶进行了体外诱变,筛选获得一个高活性突变株,相对活性是野生型的1.8倍。