论文部分内容阅读
GroEL属于分子伴侣中的伴侣素家族成员。具有典型的Hsp60家族的特征,因此也被称为热激蛋白。GroEL广泛参与到细胞重要的生命活动,帮助受损或者未成熟蛋白质进行解聚及重折叠,在细胞经历热激,盐胁迫等环境下,groELs可以大量表达,来帮助细胞度过不良环境。根据生物学分析,在接近五分子一的已经测序的细菌基因组中都包含有两个或两个以上拷贝的groELs,它们的多拷贝多是由于水平转移或者基因复制而来的,推测其与基因功能分化相关。GroELs的典型结构是由两个背靠背的环状结构以及一个盖子状的GroES组成。GroEL是一个14聚体,每个环由完全相同的七个亚基组成。GroEL和GroES的结合使GroEL原本疏水的空腔变成的亲水的空腔结构,创造一个利于多肽折叠的空腔从而帮助蛋白折叠完成。在Myxococcus xanthus DK1622中,具有两个拷贝的groELs,其中一个gr oEL1由groEL （MXAN4895）和前端的辅因子groES （MXAN4894组成,而另一个拷贝的groEL2（MXAN4467）（?）前端则缺失了groES它们在基因组成上具有81.36%的同源性,而在氨基酸组成上具有78.94%的同源性。较高的同源性,提示它们的功能具有部分的叠加却又存在着一定的差异,根据实验室前期的研究表明,在菌体受到热激等不良外界环境影响的时候,这两个拷贝的groEL均有表达量的上升,帮助细胞度过不良环境。而在粘细菌多细胞行为中,这两个拷贝的groELs分别对DK1622的发育和捕食具有相当大的影响。其中,groEL1的缺失使DK1622的发育缺陷,不能形成成熟的子实体,生孢率也只有野生型的1.43%-4.66%左右,而对于群体进行的捕食行为却没有什么影响,与野生型相差无几。但是groEL2的敲除却使菌体的捕食行为受到了严重延迟,野生型和groEL1敲除突变株均可以再12h形成可见的降解圈,而groEL2敲除突变株在48h时才产生另外,在大分子摄食行为中,groEL2敲除株的液体捕食能力的受损（生长代时较野生菌株延迟了约1h）却对发育没有影响（Li.et al.2010））本课题从双拷贝的groELs对粘球菌DK1622的社会学行为的不同影响出发,以GroEL作为分子伴侣帮助蛋白进行折叠的基本功能为立足点。。分别进行了YL0301（△groELI）和YL0302（△groEL2）在发育阶段和大分子摄食阶段免疫共沉淀,寻找GroEL I和GroEL2底物的差异性,以此来寻找GroELs的功能分化的原因。另外,我们还探究了GroELs和HrcA-CIRCE之间的相互调控机制,对groELs的作用机理有了初步的闸明。在GroEL1和GroEL2差异性底物的寻找方面,两个拷贝的GroELs的免疫共沉淀底物体现了一定的同一性和差异性。它们都参与了细胞生命活动最基础的代谢活动,如丙酮酸代谢,三羧酸循环,氧化还原,遗传信息等相关的活动。最重要的是在社会学行为方面,matrix-associated zinc metalloprotease FibA蛋白被报道与粘球菌的发育和运动都有关系,它是GroEL1和GroEL2共同作用底物。此外,GroEL I的特异底物,frizzy aggregation protein FrzCD的甲基化与发育程序的进行也是密切相关的,它影响细胞的运动,阻止聚集（子实体）的形成。而GroEL2的特异性底物,putative adventurous gliding motility protein, putative chemotaxis MotB protein,对运动都是有影响的,而且一些次级代谢产物相关的蛋白如non-ribosomal peptide synthase/polyketide synthase Tal被报道与捕食相关这些结果表明,GroELs在粘球菌的生长中具有重要作用,同时也具有功能分化。在groEL12的转录起始位点的研究中,通过利用荧光标记的引物扩增groEI.1/2的启动子区域的片段,再结合引物延伸实验,检测出groEL1和groEL2的转录起始位点,并检测到在热激条件（42℃）下,groEL2前端的启动子区域多了一个转录起始位点。这一发现也提供了groEL2在热激环境下表达量上升的一个最直接证据。在groELs的调控机制中的研究中,通过生物信息学分析发现,groEL1启动子区域含有两个CIRCE元件,而groEL2前端含有一个CIRCE元件。通过将粘球菌来源的HrcA蛋白进行异源表达,得到足量的可溶性蛋白,并进行了FPLC纯化后,得到了电泳纯的HrcA蛋白。Band-shift实验也初步阐明了groEL1前端启动子区域可以与HrcA蛋白进行结合,groEL2的启动子区域也可以结合,但是两个结合并没有将包含有CIRCE元件的片段完全阻滞。