芽孢杆菌属诱导真菌形成厚垣孢子的环肽抗生素的分离及鉴定

来源 :云南大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:gloriayl2005
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一些土壤可以天然地抑制某些真菌病害,该类土壤被称为抑病土(Disease suppressive soil),抑病土通常都有很强的土壤抑真菌作用(Soil Fungistasis)。目前被广泛接受的土壤抑真菌作用机理有两种:营养缺乏假说和抑制因子假说。近年来,越来越多的研究支持抑制因子假说。而对于镰刀属真菌在土壤中形成厚垣孢子,则被Lockwood,Ford等认为是土壤抑真菌作用的一种表现形式,并认为是由细菌产生的抗生素诱导的。   芽孢杆菌属(Bacillus sp.)中的成员由于能产生大量不同结构的抑制病原真菌的抗生素,被认为是很好的微生物工厂,受到了广泛的研究。它们形成的芽孢能抵抗干旱,因此成为了发展有效生物农药的最好候选者。而芽孢杆菌属中的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)被首先证明能诱导镰刀菌属(Fusarium sp.)真菌形成厚垣孢子,并且厚垣孢子的形成认为可能是这些芽孢杆菌产生的抗生素诱导的。我们的前期研究发现枯草芽孢杆菌产生的环肽抗生素能在低浓度时诱导镰刀菌形成厚垣孢子。因此我们对芽孢杆菌属诱导真菌形成厚垣孢子进行了系统的研究。研究结果如下:   1.活性细菌筛选研究。以淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)和禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)为靶标,用抗真菌模型结合诱导厚垣孢子活性模型从实验室保藏的细菌中筛选出4株具有诱导活性的菌株,分别是枯草芽孢杆菌C2,解淀粉芽孢杆菌(B.amytoliquefaciens)FZB42,地衣芽孢杆菌WE3和杀线虫芽孢杆菌(B.nematocida)B16,这些菌株的诱导活性明显。将生物模型扩大到土壤中筛菌,从小麦种植地土壤中分离出了315株细菌中筛选出17株具有诱导真菌形成厚垣孢子活性的菌株。   2.枯草芽孢杆菌发酵液中活性化合物的分离纯化。对枯草芽孢杆菌进行大量发酵,通过有机溶剂萃取、凝胶层析、硅胶层析和HPLC等分离方法对具有诱导活性的次生代谢产物进行分离,摸索并制定出一整套纯化方法,从活性组分中分离到3个活性化合物,其中一个活性化合物通过碳谱、氢谱、NOESY、TOCSY和MS等图谱数据,鉴定其结构为环肽抗生素FengycinA1,分子量为1477,分子式为C74H113N11020;另外2个活性化合物根据MS检测,推测为FengycinA的同系物。用琼脂扩散法测定了FengycinA1对串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)的最低抑菌浓度(MIC)为1281μg/mL,研究结果发现FengycinA1在不同浓度时对串珠镰刀菌的影响不同:FengycinA1在0.5μg/ml的低浓度时就能诱导串珠镰刀菌形成菌丝厚垣孢子:浓度为MIC时完全抑制串珠镰刀菌的生长,孢子不萌发,观察到大量孢子厚垣孢子的形成;而在512μg/ml的高浓度时则引起了串珠镰刀菌孢子的裂解。   3.研究了FengycinA的同系物诱导真菌形成厚垣孢子的诱导谱。我们选取了16株文献报道产厚垣孢子和不产厚垣孢子的真菌,使用滤纸片扩散法进行活性测试,FengycinA在低浓度下能诱导所有这16株菌产生厚垣孢子。而不同真菌对FengycinA抑菌活性的敏感度有差异:其中最敏感的为捕食线虫真菌鞭式节丛孢(Duddingtonia flagran)、多孢节丛孢(Arthrobotrys superba)和椭圆单顶孢(Monacrosporium ellipsosporum),它们形成很大的抑菌圈;而日本根霉(Rhizopus japonicus)和镰刀菌(Fusarium sp.)等真菌则非常不敏感,抑菌圈很小甚至没有。   4.地衣芽孢杆菌活性进行组分的初步分离分析和研究。通过小量发酵,对发酵液中的活性组分进行分离。其活性组分具有抑菌活性,并在茚三酮显色剂作用下显粉色,TLC和HPLC分析发现其活性组分与枯草芽孢杆菌活性组分不同,应为另一类肽类抗生素。   本论文的创新性体现为:   1.首次发现解淀粉芽孢杆菌和杀线虫芽孢杆菌具有诱导真菌形成厚垣孢子的能力。   2.建立了分离纯化诱导形成厚垣孢子形成的环肽类纯品化合物的方法。   3.首次发现FengycinA具有诱导真菌形成厚垣孢子的活性。
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