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离子通道（受体）（例如电压门控通道、机械门控通道和配体门控通道等）在许多生物体内的生理活性中起着非常重要的作用。离子通道（受体）的功能异常或者功能失常会导致许多疾病的发生,例如慢性疼痛、心脏或脑疾病、关节炎以及运动障碍等。天然多肽（2-50个氨基酸分子）可以作为调节分子与离子通道（受体）分子相互作用。对于活性多肽功能高通量的活性研究最重要的两个限速步骤为:1)是否能够快速的进行基因克隆操作,在较短的时间内构建大量的表达载体;2)该表达载体是否能够获得二硫键正确折叠的活性多肽。针对这两个瓶颈,本论文首先建立了一种新的基因克隆方法——OEPR克隆,其最重要的特点就是OEPR克隆把基于重叠延伸PCR方法和基于同源重组的方法完美地结合到了一起。OEPR克隆通过在插入基因的上游引物和下游引物的5’端分别引入一段与载体插入位点同源的序列。上游引物5’端引入的同源序列为15-30个碱基,用于同源重组反应;下游引物5’端引入的同源序列的Tm值为68-70℃,用于重叠延伸PCR反应。通过两步PCR反应之后,可以获得一条线性的目的质粒,其两端具有一段同源序列（15-30 bp）,可以帮助其在大肠杆菌体内被修复成完成的环状质粒。OEPR克隆方法可以有效地将大片段（1-6 kbp）插入载体（pGADT7,7988 bp）中,当同源重组臂为30 bp时,其阳性率可以达到80%左右。OEPR克隆方法还可以进行多个大片段（两个1 kbp,两个2 kbp,两个3 kbp,三个1 kbp,三个2 kbp和四个1 kbp基因）插入载体（pGADT7,7988 bp）中,当同源重组臂为30 bp时,其阳性率可以达到80%左右。OEPR克隆是一种有效的且省时省力的无缝克隆方法,此方法可以成功地将单个大片段或者多片段无缝整合到载体的插入位点区域。利用OEPR克隆可以高效地进行一些基于质粒的基因操作,例如基因突变,基因的嵌合体构建,多基因的融合等。另外本论文还建立了一种新的大肠杆菌分泌表达与纯化系统,可以用于表达与纯化富含半胱氨酸的活性多肽。该系统的开放阅读框依次包括信号肽,6×His纯化标签,SUMO融合标签和毒素分子。其中信号肽来源于枯草芽胞杆菌G1菌株中的环糊精葡糖基转移酶中的信号肽突变体M5。SUMO融合标签在本研究中既作为助溶标签,又作为酶切位点。ULP1激酶可以识别SUMO蛋白质的结构,而在其末端的两个甘氨酸的C端处进行切割。ULP1激酶的识别效率高,且不会给毒素分子引入多余的氨基酸。为了检测此分泌表达系统的效果,我们选择了HWTX-I和HNTX-IV毒素分子——HWTX-I来源于虎纹捕鸟蛛,其具有33个氨基酸残基,三对二硫键;HNTX-IV来源于海南捕鸟蛛,其具有35个氨基酸残基,三对二硫键。我们首先通过OEPR克隆方法将G1M5信号肽分子插入pET-SUMO载体中6×His纯化标签的5’端构建中间载体pSE-G1M5-SUMO,然后再用OEPR克隆方法将HWTX-I和HNTX-IV毒素分子的基因分别插入pSE-G1M5-SUMO载体中SUMO融合标签的3’端构建分泌表达载体pSE-G1M5-SUMO-HWTX-I和pSE-G1M5-SUMO-HNTX-IV。然后分别将此分泌表达载体转化至大肠杆菌表达菌BL21（DE3）中,通过大肠杆菌自动诱导表达系统表达融合蛋白质,然后分泌到培养基中。通过离心获得自动诱导培养后的菌液上清,然后将上清流经弱阳离子交换树脂进行富集,然后再通过Ni-NTA树脂进行亲和纯化从而获得较纯的融合蛋白质。对于纯化后的融合蛋白质通过超滤脱盐浓缩后在ULP1激酶的作用下切掉SUMO标签从而释放出相应的HWTX-I和HNTX-IV毒素分子,然后通过RP-HPLC纯化获得高纯度的HWTX-I和HNTX-IV毒素分子,在215 nm下的检测色谱吸收峰。通过MALDI-TOF质谱鉴定,表达出的rHWTX-I和rHNTX-IV的鉴定分子量分别为3750.8 Da和3987.6 Da,分别与其理论分子量3750.43 Da和3986.58 Da相一致,并且通过全细胞膜片钳系统检测了其电生理活性。实验表明纯化后的rHWTX-I和rHNTX-IV在10μM的浓度下均可以抑制表达在HEK293细胞上的hNav1.7离子通90%以上的电流,并且其IC50值分别为500 nM和126 nM,与其野生型生理活性（630 nM和34 nM）基本一致。以上实验结果表明此分泌表达系统可以成功表达并纯化到具有正确的二硫键折叠的毒素分子HWTX-I和HNTX-IV。该分泌表达纯化系统可以应用于其它的富含半胱氨酸的多肽毒素的表达纯化。