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传染性法氏囊病(Infectious bursal disease, IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)引起鸡的急性、高度接触性传染病,是危害世界养禽业的主要传染病之一。该病毒主要侵害鸡的中枢免疫器官——法氏囊,从而导致免疫抑制,造成对其他疫病的易感性增强。近年来,IBDV分子生物学研究虽然取得了较大进展,但在分子水平对IBDV的免疫机理、致病机制、病毒分子的结构与功能方面仍有许多问题有待于进一步深入研究。而鉴定IBDV抗原表位则有助于揭示病毒与机体相互作用的本质,从而进一步探索IBDV的致病机制和免疫机理。抗原表位,又称抗原决定簇,它是蛋白质抗原性的物质基础,具有刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞并能够与之抗体结合或致敏淋巴细胞识别的特性,在蛋白质抗原的结构与功能中扮演着重要的角色。可见正确而详细地绘制抗原表位图谱对疾病的诊断、设计无毒副作用的多表位疫苗以及免疫治疗试剂等具有积极的意义。目前在预防医学领域许多关于以表位为基础的,如表位疫苗和特异性诊断试剂等的研究也就成了热点。而多表位疫苗因其携带更多的中和表位信息,可以提供更多的保护,本课题以其为出发点,对IBDV多表位疫苗的分子设计及表达产物的人工保护试验进行了研究,结果证明该多表位疫苗的研究思路不仅可提供vvIBDV新的防制制剂,而且将为分子免疫学以及高效基因工程疫苗的研究奠定基础。本研究共分两部分:一、IBDV多表位串联基因的原核表达及免疫原性分析本研究室前期研究利用4株IBDV-VP2单克隆抗体(McAb)从噬菌体随机肽库中筛选得到了4个含有不同IBDV-VP2抗原表位的模拟肽序列。在此基础上,将4个抗原模拟表位用GGGS四肽连接构建多表位串联基因4epis。将该基因合成、克隆后,构建原核表达质粒pET-4epis,于大肠杆菌E.coli BL21(DE3)pLysS中表达重组多表位蛋白r4EPIS。SDS-PAGE分析表明目的蛋白获得了表达,并以包涵体形式存在,经包涵体洗涤、蛋白纯化,其纯度可达90%以上,分子量约30kDa。将纯化后的表达产物免疫SPF鸡,ELISA分析其抗血清效价在1:10240以上,Western-blot分析表明表达产物r4EPIS能与IBDV单克隆抗体发生反应,从而证明该多表位基因4epis在原核中得到了表达,且表达产物具有良好的免疫原性。这为研究超强毒IBDV的免疫机理及基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。二、IBDV-VP2多表位蛋白的人工保护试验本研究选取7日龄SPF鸡160只,随机分成8组,平均每组20只,按照以下组别进行试验:对照组、IBDV疫苗组、弗氏佐剂组、表达蛋白4EPIS组、VP2抗原组、4EPIS+弗氏佐剂(1:2) (体积比)组、4EPIS+弗氏佐剂(1:1)组和4EPIS+弗氏佐剂(2:1)组。根据组别分别于14日龄一免、21日龄二免,对照组则用生理盐水替代。7d后即28日龄时进行IBDV攻毒,分别于攻毒前、攻毒后的第3d、7d、14d的时候采样(胸腺、法氏囊、脾脏、血清等)。进行免疫器官指数、ANAE+淋巴细胞百分率、血清SOD活性以及抗体效价等的测定。试验结果表明:用200个ELD50超强毒IBDV攻击SPF鸡,4EPIS+弗氏佐剂(2:1)组攻毒保护率最高,达90%以上。说明目的蛋白r4EPIS联合免疫佐剂构建的多表位疫苗能够促进鸡体免疫器官的发育并有效的阻止IBDV对机体的损伤,能够维持较高的抗体水平、显著提高ANAE+淋巴细胞百分率和血清SOD活性,从而提高机体的免疫力。试验证明表达产物r4EPIS可诱导机体产生抗IBDV感染的保护性免疫应答,预示构建的多表位串联基因4epis可作为IBD多表位疫苗研究的候选基因。