研究背景肌筋膜疼痛综合征(Myofascial pain syndrome,MPS)是一类常见的疼痛综合征,以激痛点(myofascial trigger points, MTrPs)的出现为特征。激痛点是肌紧张带中的痛性易激惹小点,直径约为1-2毫米,受到按压、针刺等刺激时产生局部抽搐反应、牵涉痛、自发性电活动等。激痛点会造成受累肌肉肌束缩短、肌力减弱,从而导致关节活动度受限等运动功能异常。几乎每人都有激痛点,可出现于全身任意肌肉组织中,但现在对于激痛点的成因仍然存在许多争议。学者们提出几种理论,其中比较著名的是能源危机理论(整合理论)及对其做出进一步补充的Cinderella假说,认为肌肉劳损导致局部能量危机、神经活性物质释放增多并最终使外周伤害性感受器敏化,造成痛觉过敏。另一种理论——神经肌肉接头功能障碍理论认为激痛点由许多运动或感觉相关小区域组成,这些小区域各自对激痛点的运动或感觉特征负责。现有关于激痛点的研究多为人体实验,鉴于有些实验项目,特别是有创性操作,很难在人体实验开展,所以动物实验是十分必要的。既往动物实验多通过同一部位反复击打、离心运动等来诱发激痛点。考虑到这些措施多为伤害性操作,可能会对后续实验结果造成干扰(如反复多次击打等操作本身即可诱发相应脊髓层面的中枢敏化,而且会造成局部肌纤维损伤)。另外有学者使用局部注射药物的方式来诱发激痛点,但注射操作及药物可能对局部微环境造成改变。因此,需要一种更加准确的激痛点动物模型来更好的模拟人体激痛点。此外,在人体实验中,可以通过询问受试者有无局部疼痛(特别是可辨认的与既往疼痛相似者)的主观体验来协助确定激痛点。然而,在动物实验中,很难通过实验动物的主观体验来定位,仅能通过其疼痛避缩反应来衡量疼痛,却无法判断疼痛是否之前即存在,而且无法判断是否有牵涉痛的存在。因此,在动物实验中,需要有更加可靠的激痛点定位方法。既往研究显示激痛点处有痛觉过敏、痛觉超敏现象。同时有学者使用铁沉积法发现激痛点处有更多的神经纤维末梢存在。有临床报道指出有髓鞘神经纤维参与某些疼痛的传导,缺血压迫阻滞有髓鞘纤维可以缓解人体激痛点的疼痛和牵涉痛。由此我们推测,有髓鞘神经纤维可能与激痛点存在联系。本实验中,我们采用大鼠股二头肌内自然形成的激痛点作为研究对象,以更好的模拟人体激痛点。通过触诊结合肌电图定位的方式来定位：即在肌肉触诊初步定位激痛点后,使用针刺肌电图进一步确定此处是否存在激痛点特异性的自发性电活动,以此增加定位的准确性。同时,我们对此种方法取得的激痛点做了活检,并与正常肌肉组织做了对比。为进一步研究激痛点的神经支配,特别是有髓鞘神经纤维与激痛点的联系,我们采用了改良的Cajal吡啶银染色对激痛点处的神经纤维末梢进行了研究,而且通过有髓鞘神经纤维特异性抗体(NF200)的免疫组织化学实验,对激痛点的有髓鞘神经纤维分布做出进一步分析。目的1.寻找定位大鼠股二头肌中自然形成的激痛点,作为临床激痛点的动物模型。2.研究大鼠激痛点相应形态学改变,并与正常肌肉组织进行对比。3.明确大鼠激痛点的神经纤维、有髓鞘神经纤维支配情况。研究方法1.大鼠股二头肌内自然形成的激痛点／非激痛点的定位取260-270g重的清洁级Wistar大鼠,浅麻醉后俯卧位固定,清除股后部毛发。首先以触诊方式确定大鼠股二头肌内较为坚硬的肌紧张带,沿该肌紧张带挤压,当该侧下肢出现局部紧张反应时,可初步认定此处为激痛点。继而以肌电图测定,当刺入初步确定的激痛点处的刺激电极记录到自发性电活动,而刺入临近肌肉中的对照电极无自发性电活动时,可进一步确认激痛点。非激痛点处无自发性电活动且无局部紧张反应。2.大鼠股二头肌激痛点及非激痛点的取材确定激痛点／非激痛点后,保持刺激电极不动,逐层切开皮肤及皮下组织,暴露股二头肌。取下刺激电极针头附近直径3mm的肌肉。3.大鼠股二头肌激痛点／非激痛点肌肉组织的活检所取激痛点／非激痛点组织块经4%多聚甲醛固定过夜、组织脱水、石蜡包埋、组织切片,制成4μm厚的切片。光镜下观察肌纤维分布及走行等形态学改变。4.改良的Cajal吡啶银染色示激痛点／非激痛点处神经纤维按照改良的Cajal法,对取材的激痛点／非激痛点组织块依次进行：固定、硝酸银着色、焦性没食子酸还原等操作后,经过组织脱水、石蜡包埋,4μm纵／横切片、脱蜡水化、脱水透明、封片,进行光镜下观察,计数被银染为棕黑色的神经末梢数目。5.NF200免疫组化检测激痛点／非激痛点有髓鞘神经纤维取激痛点／非激痛点组织块,经4%多聚甲醛固定过夜、组织脱水、石蜡包埋,制成4μ m纵／横切面切片。进行NF200免疫组织化学方法检测激痛点／非激痛点组织中有髓神经纤维末梢,光镜下计数棕黄色的阳性神经末梢数量。6.数据处理及统计银染／NF200阳性神经纤维数目均采用平均值±标准差的方式记录,对其差异分别进行T检验。若P<0.05,认为差异有统计学意义。结果1.使用触诊结合肌电图检测自发性电活动的方法可以成功定位大鼠股二头肌内自然形成的激痛点。2.激痛点／非激痛点活检：激痛点处肌纤维排列错乱、增粗肿胀,其中可见收缩带及较多炎性细胞浸润,非激痛点处肌纤维排列整齐,无明显炎性浸润。3.改良Cajal毗啶银染色：肌肉纵切面：在激痛点和非激痛点的肌纤维间隙可见被银染为棕黑色的神经纤维沿肌纤维走向分布。肌肉横切面：激痛点处银染的神经纤维数量较多(15.97±1.67),非激痛点处银染纤维数量少(11.06±1.54),二者差异具有显著性(P<0.01)。4.NF200染色显示：肌肉纵切面：激痛点和非激痛点的肌纤维间隙均可见NF200阳性的棕黄色的神经纤维。肌肉横切面：激痛点处NF200阳性神经纤维数量较多(5.720±1.31),非激痛点处NF200阳性纤维数量较少(2.930±1.09),二者差异具有显著性(P<0.01)。结论1.肌肉触诊结合肌电图定位的方式可以确定大鼠股二头肌中自然形成的激痛点,作为人体激痛点的动物模型。2.激痛点中肌纤维排列错乱、略有肿胀,可见有紧张带形成及较多炎性细胞浸润。3.激痛点有更多的神经纤维末梢存在,特别是有髓鞘神经纤维末梢。4.结合既往临床试验结果,有髓鞘神经纤维可能与激痛点的病理过程存在联系。研究背景中枢敏化是中枢神经系统对外周刺激的过度反应,是神经性疼痛的共有机制。脊髓具有可塑性,持续传入的外周伤害性刺激可以激活脊髓背角的神经元,使脊髓背角发生重构,如神经纤维的出芽、神经元表型转变等,导致神经元表达受体种类增多、原有神经递质释放增加,或开始表达新的神经递质。上述改变可以造成外周伤害性刺激的感受阈增加,反应强度提高,即中枢敏化。动物实验中,谷氨酸受体的表达程度常作为判断中枢敏化存在与否及衡量其敏化程度的指标。既往研究显示,有髓鞘神经纤维参与了炎症及外伤引起的中枢敏化过程；亦有文献提出,激痛点对应的脊髓层面可能存在中枢敏化。在本研究第一部分中,我们发现激痛点处的有髓鞘神经纤维数目明显高于正常肌肉组织。而且之前的临床试验也证实了有髓鞘神经纤维与激痛点的疼痛、自发性电位等特异性改变存在联系。我们推测有髓鞘神经纤维可能与激痛点的中枢敏化存在联系。此外,有学者采用辣根过氧化物(HRP)神经示踪技术发现大鼠激痛点相应脊髓背根神经节中的感觉神经元有数量减少、平均体积减小的趋势。但尚无关于激痛点相应脊髓背角神经元的报道。我们首次选用了霍乱毒素亚单位结合的辣根过氧化物酶(CB-HRP),一种可特异性追踪有髓鞘神经纤维的神经示踪剂,来研究激痛点相关脊髓背角的中间神经元及脊髓腹角的运动神经元,同时判定其改变是否与有髓鞘神经纤维有关联。既往临床试验获得的多为易受到主观影响的间接证据(VAS痛觉指数等),中枢层面的形态学改变等客观证据无法得到。为了进一步深入研究有髓鞘神经纤维在激痛点病理过程中所发挥的作用,并获得更直接的证据支持,我们采用大鼠为研究对象,观察激痛点、河豚毒素特异性阻滞有髓鞘神经纤维后的激痛点对应的脊髓层面的中枢敏化情况及脊髓腹角、背角神经元大小、数目的改变,并分别与正常组织对应的脊髓层面进行比较。目的1.研究有髓鞘神经纤维与激痛点中枢敏化之间的联系。2.研究有髓鞘神经纤维与激痛点对应脊髓神经元大小、数目改变的联系。研究方法1.谷氨酸受体免疫组织化学实验。1)动物分组：24只确定存在股二头肌自然形成的激痛点的Wistar雄性大鼠被随机均分为激痛点组／生理盐水组／河豚毒素组,另外8只确定不存在股二头肌激痛点的Wistar雄性大鼠用作正常对照组。2)实验动物处理及取材：生理盐水组和河豚毒素组：分别在激痛点处注入0.1ml生理盐水/0.1ml 1μM的河豚毒素,每24小时一次,共6次。最后一次注射操作24小时后,大鼠经深度麻醉、多聚甲醛心脏灌注固定,取激痛点对应脊髓(L5)层面；经后固定、梯度沉糖、OCT包埋、切片,制成8μm厚的脊髓横切面冰冻切片。正常组和激痛点组：不做特殊处理,同样制得脊髓L5段的冰冻切片。3)免疫组化实验：分别进行这4组脊髓切片的谷氨酸受体(mGluRlα/mGluR5/ NMDAR1)相应免疫组化实验,测定其在脊髓背角的表达情况(阳性神经元位置、阳性神经元比率)。4)数据处理及统计：所有数据均以平均值±标准差的形式表示。对其进行正态分布分析后,选用单因素方差分析及Newman-Keuls Multiple Comparison Test后检验分析各组阳性神经元率差异。若P<0.05,认为差异具有统计学意义。2. CB-HRP神经示踪技术研究激痛点／非激痛点对应脊髓层面神经元。1)动物分组：24只确定存在股二头肌自然形成的激痛点的Wistar雄性大鼠被随机均分为激痛点组／生理盐水组／河豚毒素组,另外8只确定不存在股二头肌激痛点的Wistar雄性大鼠用作正常对照组。2)动物处理：生理盐水组和河豚毒素组：分别在激痛点处注入0.1 ml生理盐水/0.1 ml 1μM的河豚毒素,每24小时一次,共6次。最后一次注射24小时后,在激痛点处以微量注射器注入20μl CB-HRP。正常组和激痛点组：在股二头肌非激痛点处／激痛点处以微量注射器注入20μl CB-HRP 。3)取材：注入CB-HRP 48小时后,大鼠深度麻醉,分别以生理盐水、固定剂(由多聚甲醛、蔗糖、磷酸缓冲液配制而成)、蔗糖行心脏灌注固定,取脊髓L5段,经梯度沉糖、OCT包埋、切片,制成10μm厚的脊髓横切面冰冻切片。4)观察被标记神经元的位置分布；根据被标记神经元位置及与疼痛的联系,对脊髓背角诸板层的中间神经元及脊髓腹角的运动神经元,分别进行数量和平均直径的分析。5)数据处理及统计：所有数据均以平均值±标准差的形式来表示。对其进行正态分布分析后,选用单因素方差分析及Newman-Keuls Multiple Comparison Test后检验分析各组结果差异。若P<0.05,认为差异具有统计学意义。结果1.谷氨酸受体免疫组化实验。1)在4组结果中,mGluR1α/mGluR5/NMDAR1在脊髓背角的表达位置基本相同：mGluRla位于脊髓背角深层(第Ⅲ-Ⅳ板层)、mGluR5多表达于第Ⅰ-Ⅱ板层、NMDAR1阳性神经元可见于整个脊髓背角。2)根据上述每个受体的表达部位分别进行阳性神经元率检测。针对相同板层中特定受体：单因素方差分析结果显示各组阳性神经元率有显著统计学差异(P<0.05)：激痛点组、生理盐水组的阳性神经元率最高,河豚毒素组阳性神经元率居中,正常组最低；Newman-Keuls Multiple Comparison Test后检验结果提示：在4组中,激痛点组和生理盐水组二者无显著差异(P>0.05),其余组间两两比较均存在显著差异(P<0.05)。2.CB-HRP神经元标记。1)在4组结果中,可以在脊髓全层见到被CB-HRP标记为亮蓝绿色的神经元,其位置基本相同：脊髓背角第Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ板层及第V板层的外侧1/3部分及脊髓腹角第Ⅸ板层标记神经元最多。根据被标记神经元所在位置与伤害性刺激的关系,对其进行具体定量分析。2)CB-HRP神经元直径：对于脊髓背角第Ⅰ、Ⅳ板层、第V板层(外1/3部分)、脊髓腹角第Ⅸ板层中的某一特定板层：单因素方差分析提示各组平均直径有显著差异(P<0.05)：激痛点组、生理盐水组的标记神经元直径最小,河豚毒素组居中,正常组最大；Newman-Keuls Multiple Comparison Test后检验结果提示激痛点组和生理盐水组二者无显著差异(P>0.05),其余组间两两比较均存在显著差异(P<0.05)。3) CB-HRP神经元数目：对于脊髓背角第Ⅰ、Ⅳ板层、第V板层外1/3部分中的相同部位,单因素方差分析结果显示4组间有差异(P<0.05)：激痛点组、生理盐水组的标记神经元数目最少,河豚毒素组居中,正常组最多,Newman-Keuls Multiple Comparison Test后检验结果提示激痛点组和生理盐水组二者无显著差异(P>0.05),其余组间两两比较均存在显著差异(P<0.05)。对于脊髓腹角第Ⅸ板层：单因素方差分析结果显示4组间有差异：正常组的标记神经元数目最多,激痛点组、生理盐水组河豚毒素组数目较少(P<0.05),Newman-Keuls Multiple Comparison Test后检验结果提示：生理盐水组、激痛点组、河豚毒素组的标记神经元数目较正常组明显减少(P<0.05),这三组中,生理盐水组数目最少,河豚毒素组最多,但三者之间两两比较的差异无统计学意义(P>0.05)。结论1.有髓鞘神经纤维与激痛点对应脊髓的中枢敏化有关。2.有髓鞘神经纤维与激痛点对应脊髓中枢的腹角、背角神经元的可塑性变化有关。3.河豚毒素特异性阻断有髓鞘神经纤维可以逆转上述中枢性改变。