研究目的骨修复材料中,相比于自体骨和人工假体,同种异体骨具有来源丰富,不受大小、形态限制,具有生物活性的特点,临床应用前景较好。但目前骨库常用同种异体骨的制备方法不能完全消除其免疫原性,且会对同种异体骨的成骨性能及生物力学性能产生损害。鉴于此,裴国献、陆海波采用复合环孢菌素并低温等离子体灭菌的方法制备了复合环孢菌素的同种异体骨(CAB),并申请到国家发明专利(一种新型同种异体骨及其制备方法,200610122058)。本实验目的：(1)对CAB的体外药物释放特性进行评价,考察其药物负载方式及负载量是否合理；(2)对CAB与骨库常用冻干同种异体骨(FDAB)的骨缺损修复效果及植入后引发的免疫反应进行比较研究。实验方法第一部分复合环孢素同种异体骨体外药物释放研究1空气栓塞处死新西兰兔4只,无菌条件下切取双侧髂骨。经清洗、切削、打磨制成松质骨块。参照文献方法制备CAB：室温下30%双氧水浸泡24 h脱蛋白,再以氯仿、甲醇、水各90、90、20 ml为萃取剂,水浴温度为65℃,在索氏脂肪萃取器中连续脱脂48 h。将上述脱蛋白脱脂骨浸于0.6 ml95%乙醇溶液中,室温下振荡90 min,5000r/min离心20 min,37℃恒温箱中干燥12 h,称重得质量M1,再将上述骨块浸于0.6 ml环孢素乙醇溶液(环孢素在95%乙醇中的浓度为0.5g/L)中,室温下振荡90min,5000 r/min离心20 min,37℃恒温箱中干燥12h,制得CAB,称重得质量M2, CAB上负载药物的质量为M2与M1之差,平均0.0998 g。2取上述脱蛋白脱脂骨及CAB,临界点干燥后喷金,进行扫描电镜观察。3以300mL含0.2%SDS的生理盐水为溶出介质,37℃±5℃、转速70r/min条件下恒温振荡器中分别对5块CAB进行药物释放实验。于规定时间取样2ml,每次取样后立即补充同温度同体积的新鲜介质。样品5000r/min离心2 min,取上清液进行HPLC测定,计算药物浓度及累计溶出百分率。数据为5组数据的平均值。色谱条件：色谱柱(Agilent C18, 4.6 mm×250 mm,5μm),流动相：甲醇：水(85：15),流速：1.0mL/min,检测波长：210nm,柱温55℃,进样体积20μl。第二部分复合环孢菌素同种异体骨与冻干同种异体骨移植后免疫学比较160只新西兰兔随机分为3组：材料提供组、实验组、对照组,每组20只。材料提供组动物空气栓塞处死,无菌条件下切取双侧髂骨。经清洗、切削、打磨制成松质骨块,骨块随机分为两组,每组20块。一组参照文献方法制备CAB：室温下30%双氧水浸泡24 h脱蛋白,再以氯仿、甲醇、水各90、90、20 ml为萃取剂,水浴温度为65℃,在索氏脂肪萃取器中连续脱脂48 h。将上述骨块浸于0.5g/L环孢菌素乙醇溶液中,室温下振荡90min,5000 r/min离心20min,37℃恒温箱中干燥12 h,真空封装后行低温等离子体灭菌。另一组参照文献方法制备FDAB:材料被4℃冷藏30 min,-20℃冷冻12h,-70℃深冻7d,然后于冷冻干燥机中冻干24 h,冻干结束后材料残余水量低于6%。真空封装后,材料经60Coγ射线行辐照灭菌,辐照剂量为25 kGy,辐照时间为17h。兔耳缘静脉麻醉(3%戊巴比妥钠30mg/kg)。严格无菌条件下截取右侧桡骨中段10mm骨,同时去除该段骨膜及骨间膜,造成完全性骨缺损。实验组植入CAB修复,对照组植入FDAB修复。依次缝合肌层皮肤,无菌包扎。术后每天以青霉素肌注,连续3d,常规饲养。2分别于术后2、4、8、12周各处死每组动物5只,处死前耳缘静脉分别采血1.5 ml于肝素抗凝采血管中。处死后于清洁条件下迅速解剖取出右侧桡骨原缺损范围内骨组织段,将其分为近端、远端、中间三段,分别切取100 mg骨块。所取血液、骨组织置-80℃保存。吸取血标本1ml于1.5ml离心管中,5000r/min离心3 min,取上清100μl按试剂盒说明书进行操作分别测定IL-2、TNF-aOD值。300 mg骨标本中加入3mlPBS液,捣碎匀浆机制成匀浆,吸取匀浆液1 ml于1.5 ml离心管,5000r/min离心3 min,取上清100μl按说明书进行操作分别测定IL-2、TNF-aOD值。IL-2试剂盒采用竞争法原理,OD值越高,浓度越小；TNF-a试剂盒采用夹心法原理,OD值越高,浓度越高。第三部分复合环孢菌素同种异体骨与冻干同种异体骨修复骨缺损效果比较145只新西兰兔随机分为3组：材料提供组、实验组、对照组,每组15只。材料提供组动物空气栓塞处死,无菌条件下切取双侧髂骨。经清洗、切削、打磨制成松质骨块,骨块随机分为两组,每组15块。一组参照文献方法制备CAB：室温下30%双氧水浸泡24 h脱蛋白,再以氯仿、甲醇、水各90、90、20 ml为萃取剂,水浴温度为65℃,在索氏脂肪萃取器中连续脱脂48 h。将上述骨块浸于0.5g/L环孢菌素乙醇溶液中,室温下振荡90min,5000 r/min离心20 min,37℃恒温箱中干燥12h,真空封装后行低温等离子体灭菌。另一组参照文献方法制备FDAB:材料被4℃冷藏30 min,-20℃冷冻12 h,-70℃深冻7 d,然后于冷冻干燥机中冻干24 h,冻干结束后材料残余水量低于6%。真空封装后,材料经60Coγ射线行辐照灭菌,辐照剂量为25 kGy,辐照时间为17 h。兔耳缘静脉麻醉(3%戊巴比妥钠30mg/kg)。严格无菌条件下截取右侧桡骨中段10mm骨,同时去除该段骨膜及骨间膜,造成完全性骨缺损。实验组植入CAB修复,对照组植入FDAB修复。依次缝合肌层皮肤,无菌包扎。术后每天以青霉素肌注,连续3d,常规饲养。2术后1、3、6月,每组各取5只动物行空气栓塞处死。摄取右桡骨正位X线片。采用Lane-Sandhu法X射线摄片评分标准进行评分。解剖、剥离右侧尺桡骨进行大体观察后,截取植骨区骨段以10%中性福尔马林固定,20%甲酸脱钙,70%-100%乙醇梯度脱水,石蜡包埋后进行4μm连续横行、纵行切片,马松染色后光镜下观察。结果第一部分复合环孢素同种异体骨体外药物释放研究1扫描电镜观察：未复合环孢素的脱蛋白脱脂骨由许多骨小梁组成,骨小梁呈立体网状结构,网架间可见大小不一的网眼,高倍镜下可清楚看到骨小梁表面胶原纤维排列走向。CAB在扫描电镜下观察可看到：骨块表面及骨块内部骨小梁表面被环孢素结晶涂布覆盖,胶原纤维走向不可见,同时还可以看到制样过程中药物结晶干燥形成的裂纹。2药物释放：CAB在前3d药物释放速度较快,随后减慢并趋于稳定,药物持续释放可维持90d以上。第二部分复合环孢菌素同种异体骨与冻干同种异体骨移植后免疫学比较1血中IL-2 OD值结果显示：两组之间无显著性差异(F=0.001,P=0.970),不同时间点之间无显著性差异(F=0.058,P=0.764),分组与时间之间不存在交互效应(F=0.493,P=0.690)。从各时间点看,术后2、4、8、12周两组之间均无差异(t值分别为0.998、0.474、0.287、0.590,P值分别为0.362、0.648、0.782、0.572)。从不同组看,两组不同时间点之间均无差异(F值分别为0.843、0.134,P值分别为0.495、0.938)。2移植部位骨块中IL-2 OD值结果显示：两组及不同时间点之间均存在显著性差异(F值分别为12.128、3.985,P值分别为0.001、0.016),分组与时间之间存在交互效应(F=3.859,P=0.018)。从各时间点看,术后2、4周实验组高于对照组,差异有统计学意义(t值分别为3.858、2.990,P值分别为0.005、0.017)；术后8、12周两组之间无差异(t值分别为0.332、0.025,P值分别为0.748、0.981)。从不同组看,实验组不同时间点之间无显著性差异(F=0.045,P=0.987)；对照组不同时间点之间存在显著性差异(F=8.896,P=0.001),采用LSD法进行两两比较发现：术后2周低于其他三个时间点,差异有统计学意义(P值分别为0.028、0.001、0.000),术后4、8、12周之间无显著差异(P值分别为0.072、0.050、0.850)。3血中TNF-αOD值结果显示：两组之间无显著性差异(F=0.006,P=0.941),不同时间点之间无显著性差异(F=0.330,P=0.804),分组与时间之间不存在交互效应(F=0.491,P=0.691)。从各时间点看,术后2、4、8、12周两组之间均无差异(t值分别为0.772、0.233、1.718、0.048,P值分别为0.462、0.822、0.124、0.963)。从不同组看,两组不同时间点之间均无差异(F值分别为0.793、0.230,P值分别为0.515、0.847)。4移植部位骨块中TNF-αOD值结果显示：两组及不同时间点之间均存在显著性差异(F值分别为30.158、12.445,P值均小于0.001),分组与时间之间存在交互效应(F=12.791,P<0.001)。从各时间点看,术后2、4周实验组低于对照组,差异有统计学意义(t值分别为5.871、3.107,P值分别为0.000、0.015)；术后8、12周两组之间无差异(t值分别为0.181、0.170,P值分别为0.861、0.869)。从不同组看,实验组不同时间点之间无显著性差异(F=0.072,P=0.974)；对照组不同时间点之间存在显著性差异(F=21.797,P<0.001),采用LSD法进行两两比较发现：术后2周低于其他三个时间点,差异有统计学意义(P值均小于0.001),术后4周高于术后8周,差异有统计学意义(P=0.048),术后4、8周比较和术后8、12周比较均无显著差异(P值分别为0.059、0.911)。第三部分复合环孢菌素同种异体骨与冻干同种异体骨修复骨缺损效果比较1大体观察：术后1月,实验组骨缺损区已形成骨连接,CAB周围由新生骨包绕,异体骨与受体骨紧密融合；对照组缺损区可见新生骨由缺损区两端向中心生长,但成骨量远小于实验组,异体骨与自体骨融合性不及实验组。术后3月,实验组骨缺损区由致密皮质骨连接,并已完成部分塑形；对照组缺损区由骨痂连接,骨质较实验组疏松,未见明显塑形。术后6月,两组缺损区均以致密皮质骨连接,表面光滑,骨塑形效果好。2 X线片观察及评分：术后1月,实验组可见明显骨痂生长,骨折线消失；对照组骨痂生成量明显小于实验组,骨折线仍可见。术后3月,实验组缺损区已基本愈合,中央可见髓腔部分再通,骨皮质完成了部分塑形,厚度与正常骨组织接近；对照组骨缺损区骨痂较1月时明显增大,骨折线消失,但未见明显骨塑形。术后6月,实验组、对照组骨缺损区均已完成塑性,皮质骨厚度与正常骨组织相当,髓腔通畅。X线片评分结果显示：两组之间有显著性差异(F=49.741,P<0.001),不同时间点之间有显著性差异(F=119.480,P<0.001),分组与时间之间存在交互效应(F=10.344,P=0.001)。从各时间点看,术后1月、3月实验组评分均高于对照组,差异有统计学意义(t值分别为5.400、4.628,P值分别为0.001、0.002),术后6月两组无统计学差异(t=0.891,P=0.399)。从不同组看,实验组各时间点之间存在显著性差异(F=51.256, P<0.001), LSD法进行两两比较发现,随着时间的推移,评分逐渐增高(P值分别为0.001、0.000、0.000)；对照组各时间点之间存在显著性差异(F=70.568, P<0.001), LSD法进行两两比较发现,随着时间的推移,评分逐渐增高(P值分别为0.001、0.000、0.000)。3组织学观察：术后1月,实验组材料内部新生骨组织生长明显,新生胶原致密,仍可见未完全吸收、替代残存异体骨组织；对照组可见大量变性、坏死残存异体骨组织,新生骨组织较实验组少,新生胶原较为稀疏,且可见到大量炎性细胞浸润。术后3月,实验组、对照组异体骨材料均已大部吸收,由新生骨组织替代。实验组胶原排列成板层状,提示骨皮质塑形,对照组胶原排列紊乱,无明显骨塑形迹象,实验组较对照组成熟胶原含量多。术后6月,两组缺损区均以皮质骨连接,胶原均已成熟、排列成紧密层状结构。结论1 CAB药物释放性能良好,无突释及释放延迟现象。2同FDAB一样,CAB移植后不会引起全身免疫反应,但其引发的移植局部免疫排斥反应弱于FDAB。3 CAB的骨缺损修复效果优于FDAB。