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背景:在人类中枢神经系统中,胶质瘤是最为常见的原发肿瘤,而胶质母细胞瘤又是胶质瘤中恶性程度最高的一种,它以无限增殖和高度的侵袭性为主要特点。目前,临床上治疗胶质母细胞瘤的主要手段为手术联合放化疗,但是由于手术无法将其完全切除,血脑屏障的存在阻碍药物有效作用,放疗存在一定的毒副作用,因此胶质母细胞瘤的根治十分困难。目前已知胶质母细胞瘤在本质上属于多基因病变,多个基因和多种信号通路参与调控胶质母细胞瘤的发生和发展。信号转导和转录激活因子3(Signal Transducer and Activator of Transcription 3,STAT3)是其中的关键因子之一,在胶质母细胞瘤中STAT3呈异常的持续性激活状态,直接或间接调控多种癌基因从而影响胶质母细胞瘤的发生和发展、侵袭和转移,并与放化疗抵抗关系密切。因此,STAT3是胶质母细胞瘤靶向治疗研究关注的重点分子之一,明确胶质母细胞瘤中STAT3异常激活的分子机制对它的治疗具有极其重要的价值。Smads家族蛋白在蛋白结构上有很大的同源性,目前已发现有多个成员与STAT3存在相互作用,而Smad6在亚细胞分布上主要表达于细胞核,因此我们推测Smad6有可能参与调控了胶质母细胞瘤中STAT3的持续性激活。目的:研究Smad6是否调控人胶质母细胞瘤细胞的增殖能力并明确相关的分子信号机制。方法:(1)通过Western blot检测本院临床研究中心提供的原代人胶质母细胞瘤细胞中细胞核Smad6的表达水平;(2)构建慢病毒介导的Smad6细胞核稳定过表达胶质母细胞瘤细胞株和Smad6稳定敲减胶质母细胞瘤细胞株;(3)通过CCK-8细胞增殖实验检测Smad6对胶质母细胞瘤细胞增殖能力的影响;(4)通过裸鼠皮下荷瘤模型检测Smad6对胶质母细胞瘤细胞体内成瘤能力的影响;(5)通过STAT3报告基因质粒(SIE)的荧光素酶报告基因实验检测Smad6是否影响IL-6诱导的STAT3激活,并通过Western blot检测Smad6是否调控胶质母细胞瘤细胞中与增殖相关的STAT3靶基因表达。结果:(1)选取四株原代胶质母细胞瘤细胞,分别编号为GBM-1、GBM-2、GBM-3和GBM-4,Western blot检测显示Smad6的表达水平在所选取的各株细胞的细胞核中各不相同。(2)通过CCK-8细胞增殖实验检测,取接种4小时后各株细胞的吸光度值为1,显示这四株细胞的24、48和72小时增殖倍率如下:GBM-1为1.20±0.03、1.68±0.09、2.29±0.15;GBM-2为1.27±0.05、1.85±0.09、2.76±0.18;GBM-3为1.43±0.05、2.20±0.15、4.10±0.27;GBM-4为1.32±0.06、2.02±0.10、3.39±0.26。对这4株细胞的增殖能力进行两两比较,差异均具有统计学意义(P<0.05~0.001)。(3)使用皮尔逊相关性分析计算所选取的四株细胞中细胞核Smad6的表达水平与细胞增殖能力之间的相关性(r=0.968,P﹤0.05)。(4)通过荧光显微镜直接观察,在Smad6细胞核稳定过表达胶质母细胞瘤细胞株(Smad6-NLS)和它的阴性对照(Vector)、Smad6稳定敲减胶质母细胞瘤细胞株(Smad6-KD)和它的阴性对照(NC)中,均有绿色荧光蛋白表达。且Samd6-NLS和Vector的绿色荧光均聚集在细胞核中。(5)Western blot实验结果显示,与Vector相比,Smad6表达水平在Smad6-NLS组中显著增高;与NC相比,Smad6表达水平在Smad6-KD组中显著降低。(6)通过CCK-8细胞增殖实验检测这四株稳转细胞的24、48和72小时增殖倍率,取接种4小时后各组细胞的吸光度值为1,各组细胞的增殖倍率如下:Smad6-NLS为1.57±0.03、2.61±0.23、4.35±0.27;Vector为1.30±0.05、1.73±0.06、2.52±0.16;Smad6-KD为1.18±0.04、1.57±0.05、2.24±0.11;NC为1.41±0.04、2.07±0.14、3.88±0.25。Smad6-NLS和Vector、Smad6-KD和NC在72小时处的增殖倍率差异均具有统计学意义(P<0.001)。(7)在裸鼠皮下成瘤实验中记录瘤组织的大小数据并计算体积,各组细胞7、14、21和28天所形成的肿瘤体积如下:Smad6-NLS为(25.28±2.61)mm~3、(61.04±6.62)mm~3、(160.63±13.40)mm~3、(304.24±17.07)mm~3;Vector为(24.97±3.54)mm~3、(41.79±6.16)mm~3、(71.48±5.67)mm~3、(134.74±11.66)mm~3;Smad6-KD为(24.44±3.85)mm~3、(32.08±2.82)mm~3、(51.14±4.83)mm~3、(85.69±7.85)mm~3;NC为(25.00±3.01)mm~3、(42.31±3.39)mm~3、(84.56±10.68)mm~3、(164.14±14.51)mm~3。Smad6-NLS和Vector、Smad6-KD和NC在注射到裸鼠皮下28天后形成的肿瘤体积差异均具有统计学意义(P<0.001)。(8)Smad6-NLS和Vector、Smad6-KD和NC被注射到裸鼠皮下28天后,将裸鼠安乐死并取出肿瘤称重,各组细胞所形成的肿瘤质量平均为(85.00±20.17)mg、(28.88±10.36)mg、(21.25±7.78)mg、(42.13±11.89)mg。Smad6-NLS和Vector、Smad6-KD和NC在裸鼠体内形成的肿瘤质量差异均具有统计学意义(P<0.01~0.001)。(9)荧光素酶报告基因检测显示,Smad6促进IL-6诱导的SIE活性;(10)Western blot检测结果显示,Smad6显著促进与增殖相关的STAT3靶基因表达。结论:胶质母细胞瘤细胞中Smad6主要表达于细胞核,其高表达水平有利于胶质母细胞瘤细胞的增殖和体内成瘤;机制研究表明,Smad6可通过促进胶质母细胞瘤细胞中STAT3的转录调控活性促进胶质母细胞瘤细胞增殖相关的靶基因表达。