目的:初步探究雌激素保护氧化应激诱导大鼠髓核细胞凋亡的作用。方法:这项研究的目的是以离体实验探讨雌激素对氧化应激诱导大鼠髓核细胞凋亡的保护作用。为了提取大鼠原代髓核细胞,采用了胰酶消化的方法。为了使培养后贴壁的大鼠髓核细胞有助于传代,采用了含有0.2%EDTA的胰蛋白酶消化贴壁细胞,使其成为细胞悬浮液,传代培养。当细胞第3代时,重复传代步骤,为了减少细胞干预影响,确定实验分组后培养细胞,采用的细胞培养液中没有加入胎牛血清和酚红的DMEM/F12细胞培养液,该实验按时间先后顺序分为三个阶段,第一阶段实验分组为,每组为5个样本。对照组:以不含双氧水及雌激素的培养液处理;1μm/l组:加入浓度为1μm/l的双氧水干预;10μm/l组:加入浓度为10μm/l的双氧水干预,100μm/l组:加入浓度为100μm/l的双氧水干预,500μm/l组:加入浓度为500μm/l的双氧水干预,1000μm/l组:加入浓度为1000μm/l的双氧水干预,第二阶段按照作用时间来分组实验,对照组:以不含双氧水及雌激素的培养液处理;1小时组:加入浓度为500μm/l的双氧水作用1小时,3小时组:加入浓度为500μm/l的双氧水作用3小时,6小时组:加入浓度为500μm/l的双氧水作用6小时,12小时组:加入浓度为500μm/l的双氧水作用12小时,24小时组:加入浓度为500μm/l的双氧水作用24小时,第三阶段按照17β-雌二醇的浓度来分组实验,对照组:以不含双氧水、雌激素及其抑制剂的培养液处理;凋亡组:加入浓度为500μm/l的双氧水作用6小时,0.1μm/l组:加入浓度为500μm/l的双氧水及0.1μm/l的17β-estradiol作用6小时,1μm/l组:加入浓度为500μm/l的双氧水及1μm/l的17β-estradiol作用6小时,5μm/l组:加入浓度为500μm/l的双氧水及5μm/l的17β-estradiol作用6小时,10μm/l组:加入浓度为500μm/l的双氧水及10μm/l的17β-estradiol作用6小时,抑制剂组:加入浓度为500μm/l的双氧水和10μm/l的17β-estradiol及10μm/l的雌激素抑制剂作用6小时,应用:1大鼠的髓核细胞及染色后细胞核的形态是用倒置相差显微镜及荧光染色来观察;2乳酸脱氢酶毒性检测试剂盒检测乳酸脱氢酶释放量;3运用CCK-8方法测定细胞增殖活力;4实验中大鼠髓核细胞凋亡率的检测,是应用了流式细胞学计数的方法;5凋亡蛋白caspase-3在各个实验分组细胞中的表达含量的检测是采用了western蛋白印迹法;6用实时定量PCR的法来检测纤维环细胞中的caspase-3蛋白相关基因表达情况。第一阶段,大鼠的髓核细胞分别以浓度为(0,1,10,100,500和1000μm/l)的双氧水处理,研究双氧水其细胞毒性作用的剂量依赖性,第二阶段,以浓度为500μm/l的双氧水处理大鼠髓核细胞(1,3,6,12和24小时),研究双氧水其细胞毒性作用的时间依赖性,第三阶段,以浓度为(0,0.1,1,5,10μm/l)的17β-雌二醇处理大鼠髓核细胞研究17β-雌二醇其细胞保护作用的剂量依赖性。结果:1原代大鼠的髓核细胞在相差倒置显微镜下观察大部分呈现出多角形与长梭形,细胞核荧光染色后在显微镜下观察以圆形以及椭圆形居多,并且可以在细胞的细胞质内观察到分泌颗粒,大鼠髓核细胞生长到培养瓶底部贴壁需要大概24到48 h,随后进入其对数生长期,再培养7~8 d细胞即可,细胞可传至6~8代培养。细胞皱缩、空泡形成等凋亡形态可在双氧水作用过后的细胞中观察到,细胞核呈现出皱缩及裂解的形态。2乳酸脱氢酶毒性检测试剂盒检测乳酸脱氢酶释放量结果显示,在浓度依次为1μm/l、10μm/l、100μm/l、500μm/l、1000μm/l双氧水的条件下,乳酸脱氢酶的释放量分别为对照组的2.3倍、3.4倍、4.7倍、6.2倍、6.4倍,差异具有统计学意义。即双氧水引起大鼠髓核细胞乳酸脱氢酶释放量提高具有时间依赖性,此外与对照组相比较在500μm/l双氧水条件下细胞经过1小时、3小时、6小时、12小时、24小时后细胞乳酸脱氢酶释放量分别提高到2.6倍、4.5倍、6.7倍、6.8倍、6.9倍。差异具有统计学意义,即双氧水引起大鼠髓核细胞乳酸脱氢酶释放量升高具有时间依赖性。以500μm/l的双氧水处理大鼠髓核细胞6小时后,以0.1μm/l、1μm/l、5μm/l、10μm/l的17β-雌二醇处理细胞,与对照组相比其乳酸脱氢酶的释放量分别为4.9倍、3.4倍、2.2倍、1.3倍。差异具有统计学意义,即17β-雌二醇抗双氧水引起大鼠髓核细胞内乳酸脱氢酶释放量降低具有剂量依赖性。3运用CCK-8方法测定细胞增殖活力结果为在浓度依次为1μm/l、10μm/l、100μm/l、500μm/l、1000μm/l双氧水的条件下,细胞活性分别为对照组的82.17%±0.15%、67.57%±0.23%、48.63%±0.31%、27.53%±0.17%、25.87%±0.25%,差异具有统计学意义。即双氧水引起大鼠髓核细胞活性降低具有剂量依赖性,此外与对照组相比较在500μm/l双氧水条件下细胞经过1小时、3小时、6小时、12小时、24小时后细胞活性分别为对照组的78.23%±0.09%、46.87%±0.63%、23.56%±0.32%、22.63%±0.22%、21.52%±0.33%。差异具有统计学意义,即双氧水引起大鼠髓核细胞活性降低具有时间依赖性。以500μm/l的双氧水处理大鼠髓核细胞6小时后,以0.1μm/l、1μm/l、5μm/l、10μm/l的17β-estradiol处理细胞,与对照组相比其细胞活性分别为32.43%±0.21%、42.37%±0.22%、63.82%±0.35%、86.87%±0.25%。差异具有统计学意义,即17β-雌二醇抗双氧水引起大鼠髓核细胞活性降低具有剂量依赖性。4大鼠髓核细胞在不同浓度的双氧水处理下的细胞凋亡率以流式细胞学技术来观察,结果显示,双氧水在浓度为0μm/l时大鼠髓核细胞的凋亡率为0.71%±0.32%,双氧水在浓度为1μm/l时大鼠髓核细胞的凋亡率为4.66%±0.33%,双氧水在浓度为10μm/l时大鼠髓核细胞的凋亡率为8.87%±0.19%,双氧水在浓度为100μm/l时大鼠髓核细胞的凋亡率为19.62%±0.29%,双氧水在浓度为500μm/l时大鼠髓核细胞的凋亡率为31.72%±0.31%,差异具有统计学意义。即大鼠纤维环细胞的凋亡率逐渐升高与双氧水浓度的上升密切相关。以500μm/l的双氧水处理大鼠髓核细胞1小时大鼠髓核细胞的凋亡率为8.87%±0.25%,以500μm/l的双氧水处理大鼠髓核细胞3小时大鼠髓核细胞的凋亡率为17.97%±0.28%,以500μm/l的双氧水处理大鼠髓核细胞6小时大鼠髓核细胞的凋亡率为23.98%±0.35%,以500μm/l的双氧水处理大鼠髓核细胞12小时大鼠髓核细胞的凋亡率为29.35%±0.34%,以500μm/l的双氧水处理大鼠髓核细胞24小时大鼠髓核细胞的凋亡率为35.20%±0.37%,差异具有统计学意义。即双氧水引起大鼠髓核细胞的凋亡具有时间依赖性。以500μm/l的双氧水处理大鼠髓核细胞6小时后,以0.1μm/l的17β-雌二醇处理,凋亡率为21.34%±0.35%,以1μm/l的17β-雌二醇处理,凋亡率为14.90%±0.37%,以5μm/l的17β-雌二醇处理,凋亡率为7.71%±0.33%,以10μm/l的17β-雌二醇处理,凋亡率为3.19%±0.30%,差异具有统计学意义。即17β-雌二醇抗双氧水引起大鼠髓核细胞的凋亡具有剂量依赖性。5凋亡蛋白caspase-3在各个实验分组大鼠髓核细胞中的表达含量是用Western blot技术来检测。其结果显示:当对照组、双氧水浓度依次为1μm/l、10μm/l、100μm/l、500μm/l、1000μm/l时的灰度值(/GAPDH)分别为:0.16±0.03、0.24±0.02、0.32±0.02、0.39±0.03、0.41±0.04。其组间差异具有统计学意义。与对照组相比较在500μm/l双氧水条件下细胞经过1小时、3小时、6小时、12小时、24小时后的灰度值(/GAPDH)分别为:0.17±0.03、0.25±0.02、0.37±0.02、0.38±0.03、0.40±0.04。差异具有统计学意义,即双氧水引起大鼠髓核细胞活性降低具有时间依赖性。以500μm/l的双氧水处理大鼠髓核细胞6小时后,以0.1μm/l、1μm/l、5μm/l、10μm/l的17β-雌二醇处理细胞,与对照组相比其灰度值(/GAPDH)分别为:0.32±0.02、0.23±0.02、0.13±0.02、0.09±0.03。差异具有统计学意义。6转录凋亡蛋白caspase-3的基因表达含量运用了实时定量PCR检测,结果显示,当对照组、双氧水浓度依次为1μm/l、10μm/l、100μm/l、500μm/l、1000μm/l时的相对ct值(/GAPDH)分别为:0.25±0.03、0.43±0.02、0.65±0.02、1.01±0.03、1.07±0.04。其组间差异具有统计学意义。与对照组相比较在500μm/l双氧水条件下细胞经过1小时、3小时、6小时、12小时、24小时后的相对ct值(/GAPDH)分别为:0.42±0.03、0.61±0.02、0.92±0.02、1.08±0.03、1.12±0.04。差异具有统计学意义。以500μm/l的双氧水处理大鼠髓核细胞6小时后,以0.1μm/l、1μm/l、5μm/l、10μm/l的17β-雌二醇处理细胞,与对照组相比其相对ct值(/GAPDH)分别为:0.79±0.02、0.58±0.02、0.41±0.02、0.23±0.03。差异具有统计学意义。结论:研究结果表明,双氧水对大鼠髓核细胞有细胞毒性作用且具有时间依赖性及剂量依赖性--通过增加细胞的凋亡,降低细胞的活力,提高caspase-3凋亡蛋白的表达率,雌激素抗双氧水对大鼠髓核细胞的毒性作用也具有剂量依赖性。提示了氧化应激引起的髓核细胞凋亡即椎间盘退变的过程可能会被雌激素抑制。