口腔颌面部肿瘤除了发生于舌、唇、颊、唾液腺等部位外,面部皮肤肿瘤也不容忽视,而皮肤肿瘤切除或者皮肤外伤可造成皮肤缺损。皮肤损伤后创口通过来自伤口边缘的表皮化或瘢痕收缩而恢复,影响患者外貌或者解剖结构的缺陷[1]。目前治疗皮肤损伤最普通的方法是移植其他部位的完整皮肤至损伤处,对于较大面积的损伤此方法具有明显的局限性。因为皮肤的结构和功能相对简单,研究者通过结合支架材料、种子细胞和生物分子等产生表皮或真皮类似物、双层活皮肤替代物,应用于临床以修复由于创伤、烧伤、手术等造成的皮肤缺损[2-4],但是这些皮肤类似物在临床应用方面长期效果也不佳,因为它们缺乏真皮组织、皮下组织及皮肤附属器。再生医学一直是医学界的热点话题,其目的是通过再生形成功能性的活体组织来修复或代替因疾病、创伤、老化等原因损伤的或先天性缺陷的人体器官。皮肤是人体最大的器官,而且皮肤结构和功能相对简单,在再生医学领域得到广泛研究。我们课题组致力于再生出具有皮肤附属器,如毛囊、汗腺及皮脂腺的人类皮肤,此技术不仅为再生医学领域中其他组织的研究奠定基础,对于临床应用也具有重要意义。基于我们课题组的前期研究,本课题致力于进一步提高裸鼠体内再生带有成熟毛发的人类皮肤的成功率。为达到此目的,我们优化了体外人皮肤表皮细胞原代分离培养方法,改善了移植前体外细胞培养方法,并且我们已将此皮肤模型成功运用到研究皮肤创伤愈合的实验研究中。第一部分优化体外人皮肤表皮细胞原代分离的方法利于体内皮肤再生获得大量的人皮肤的真皮和表皮细胞是再生皮肤的第一步,这就需要提高细胞分离效率和细胞培养的方法。传统的分离方法是两步消化法,此方法耗时长,有一定局限性,本研究提出了一种新的原代分离方法,有效的从皮肤组织中获得需要细胞,并且探讨了相关机制:1.新的分离方法基于Y27632对于真皮细胞和表皮细胞的不同作用:我们发现Y27632能促进原代表皮细胞的生长,抑制原代真皮细胞的生长,通过镜下观察发现Y27632存在条件下原代真皮细胞贴壁少并且状态明显不佳。2.Y27632通过阻碍真皮成纤维细胞的贴壁而抑制真皮细胞的生长:通过将相同数量的真皮细胞接种在正常粘附力和低粘附力的培养皿中培养,正常培养皿中加Y27632组真皮细胞贴壁少并且状态不佳,低粘附力培养皿加以外界机械力摇晃,加Y27632组真皮细胞因贴壁能力差而更易漂浮。3.Y27632对表皮细胞和真皮细胞不同作用的有关机制研究:两种相同数量的细胞经过Y27632处理后,通过PCR和免疫荧光染色技术在mRNA和蛋白水平上检测黏附蛋白和整合素家族的表达,我们发现当表皮细胞经Y27632处理后整合素家族mRNA表达明显增高,但是黏附蛋白的mRNA表达没有明显影响;当真皮细胞经Y27632处理后整合素家族mRNA表达没有明显影响,但是黏附蛋白的mRNA明显降低。蛋白水平上通过免疫荧光染色我们发现加入Y27632后真皮细胞黏着斑蛋白vinculin阳性表达量明显降低,表皮细胞整合素a 6阳性表达量升高,说明Y27632能促进表皮细胞贴壁,阻碍真皮细胞贴壁,我们可以通过是否加入Y27632而从真皮细胞和表皮细胞的混合液将两种细胞分离出来。4.基于Y27632和新型G-培养基我们建立表皮细胞分离培养的新方法,能够快速有效的获得多潜能的表皮细胞:利用五种培养基培养原代表皮细胞,我们发现G-培养基最利于表皮细胞贴壁生长,Y27623结合G-培养基更加优化分离方法;将传统两步消化法和新方法比较,我们发现新方法较传统两步消化法一定时间内获得的表皮细胞数量更多,且形成细胞克隆数量多。新方法获得的表皮细胞多潜能性高,当与真皮细胞混合体内移植时可以在裸鼠体内成功再生出人类皮肤。第二部分改善移植前人皮肤组织细胞体外培养方法提高人皮肤再生效率我们课题组已利用胚胎组织来源的表皮细胞和真皮细胞成功再生出带有成熟毛发的人类皮肤,而利用成人组织来源的细胞再生皮肤仍是一大难题,本部分中我们通过改善移植前胚胎组织来源的表皮细胞和真皮细胞体外培养方法来提高皮肤再生成功效率,为将来利用成人组织来源的细胞再生皮肤奠定技术基础。1.表皮细胞膜片结合2D贴壁培养的真皮细胞代替传统方法进行体内移植:将表皮细胞提前制作成细胞膜片,结合普通2D贴壁培养条件下消化得到的真皮细胞悬浮液,移植体内,利用此方法移植20只裸鼠,3个月后其中9只(45%)裸鼠背部皮肤可以再生出带有毛发的人类皮肤,其中6只皮肤较大且毛发较多;HE染色显示再生组织皮肤组织由表皮组织、真皮组织及皮下组织组成,并可见成熟的毛囊结构,类似于人类皮肤;通过人特异性抗体Human Nuclei染色,验证新生皮肤中细胞主要来源于体外培养移植的表皮细胞和真皮细胞。2.表皮细胞膜片结合3D悬浮聚合培养的真皮细胞代替传统方法进行体内移植:表皮细胞提前制作成细胞膜片,结合3D悬浮聚合培养离心所得的真皮细胞悬浮液移植体内。利用此方法移植40只裸鼠,3个月后其中31只(77.5%)裸鼠背部皮肤可以再生出带有毛发的人类皮肤,其中21只皮肤较大且毛发较多;HE染色显示再生组织皮肤组织由表皮组织、真皮组织及皮下组织组成,并可见成熟的毛囊结构,类似于人类皮肤;通过人特异性抗体Human Nuclei染色,验证新生的皮肤中细胞主要来源于体外培养移植的表皮细胞和真皮细胞。3.表皮细胞膜片结合不同培养条件下的真皮细胞体内移植方法的比较:通过以上两种方法的比较我们发现,表皮细胞膜片结合3D悬浮聚合培养的真皮细胞进行体内移植能够更加有效的再生人类皮肤,并且形成毛发更多;通过荧光实时定量PCR实验分析我们发现3D悬浮聚合培养的真皮细胞Wnt5a和Versican的mRNA表达量明显高于2D贴壁培养的细胞Wnt5a和Versican的mRNA表达量,综上说明悬浮聚合3D培养的真皮细胞比普通贴壁2D培养的真皮细胞具有更高的促进毛发再生的能力,前者结合表皮细胞膜片时再生带有毛发的人类皮肤成功率更高。第三部分探讨再生皮肤模型的应用之一:创伤皮肤模型的建立皮肤创伤愈合过程中真皮重塑、瘢痕形成等的研究对临床有着重要的意义,但目前仍没有理想的体内动物模型来研究人类皮肤创伤的愈合过程,小鼠皮肤结构和创伤愈合过程与人类皮肤相差很大,不能真实的反映人类皮肤愈合情况,应用研究有一定局限性。因此建立良好的体内皮肤创伤模型对于了解创伤愈合的过程以及改善治疗方案有着重要作用。本部分在人类皮肤模型的基础上构建了皮肤创伤模型。1.基于再生皮肤的皮肤创伤模型成功构建:分别于裸鼠背部皮肤和3个月的再生皮肤做直径2mm的创伤,通过肉眼观察和组织学分析发现裸鼠皮肤1周左右创伤基本愈合,再生皮肤2周左右创伤基本愈合,8周时愈合表皮分层明显,真皮层基质较多,但仍处于真皮构建过程中,此过程是之前文献所没有报道过的。2.验证新生皮肤的表皮层能够正常分化:通过表皮层分化相关因子(K5,K10,Loricrin)免疫荧光染色观察发现再生皮肤创伤之后新生的表皮能正常发生分化,恢复正常功能,进一步证明再生皮肤创伤后能自行愈合。3.验证新生皮肤的表皮细胞和真皮细胞来源于人类细胞:通过免疫荧光染色所示创伤处修复皮肤的表皮细胞呈现Pan-ck阳性表达,这代表新生皮肤的表皮细胞来源于人的表皮细胞;修复皮肤的真皮层细胞主要表达Vimentin阳性,代表新生皮肤的真皮细胞主要来源于人的真皮细胞;新生表皮中约有98%表皮细胞呈现HuNuclei阳性表达,但是新生真皮中由HuNuclei阳性表达细胞和部分HuNuclei阴性表达细胞组成,真皮组织中也存在着鼠源性的免疫细胞,以上数据表明新生皮肤的表皮细胞和真皮细胞主要来源于移植的体外培养的人的细胞,愈合过程接近正常皮肤的愈合过程。4.此皮肤创伤模型为研究创伤愈合过程的相关机理提供了良好的体内实验基础:我们通过GFP标记表皮细胞或真皮细胞从而构建出带有绿色荧光蛋白的再生皮肤,经创伤处理后发现愈合过程同未标记的再生皮肤愈合过程相同,并且通过免疫组化观察发现新生皮肤的表皮细胞和真皮细胞来源于移植的带有绿色荧光蛋白的人的表皮细胞和真皮细胞。