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金黄色葡萄球菌(S.aureus)是引起奶牛乳腺炎的常见致病菌,常引起持续慢性胞内感染。自噬是细胞内关键的降解机制,参与消除入侵细胞的致病微生物。然而,部分微生物已经进化出一些策略来对抗自噬。硒是哺乳动物必需的微量元素,对动物机体免疫功能和炎症反应具有显著的调控作用。因此本试验研究S.aureus胞内感染奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)与自噬之间的关系以及硒对S.aureus感染BMECs自噬及胞内细菌增殖的影响,为S.aure 性奶牛乳腺炎的防治提供理论依据。(1)为探究S.aureus胞内感染对BMECs自噬的影响,实验用S.aureus以MOI=1:1接种于BMECs,建立胞内感染模型。分别于感染1、2、3和4 h后,采用Western blot检测自噬相关蛋白的表达;胞内感染3h后,采用免疫荧光法检测LC3的表达,通过GFP-LC3与溶酶体标志物的共定位检测自噬溶酶体的形成情况。实验结果显示:S.aureus胞内感染BMECs 2、3和4 h时,感染组的LC3-Ⅱ水平较空白对照组极显著升高(p<0.01);感染组细胞内p62的蛋白水平在感染3和4 h时,较空白对照组有极显著升高(p<0.01)。荧光检测结果显示:S aur.组中细胞浆及核周围可见明显的绿色LC3聚点,但是绿色聚点与溶酶体红色斑点并无明显的共定位现象。(2)为探究自噬调控对S.aureus感染BMECs胞内增殖的影响,自噬调控剂被加入至S.aureus胞内感染模型。胞内感染3h后,检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和p62的表达;胞内感染1、2、3和4 h后,通过胞内细菌载量检测BMECs中S.aureus的增殖情况。实验结果显示:rapamycin和S.aureus共处理时,与S.aurus组相比,LC3-Ⅱ蛋白表达无明显差异(p>0.05),p62蛋白表达显著增加(p<0.05),细胞内细菌数量随时间推移显著或极显著增多(p<0.05或p<0.01);CQ和S.aurus共处理时,与S.aureus组相比,LC3-Ⅱ蛋白表达极显著(p<0.01)升高,p62蛋白表达差异不明显。在所有测试时间,细胞内细菌的数量极显著(p<0.01)高于S.aureus组中的细菌数;在3-MA和S.aureus共处理组中,与S.aureus相比,LC3-Ⅱ蛋白表达极显著降低(p<0.01),p62蛋白表达差异不明显。在2、3和4 h时细胞内细菌数量极显 著(p<0.01)低于S.aureus组。(3)为探究硒对S.aureus感染下BMECs自噬及胞内细菌增殖的影响,先将BMECs用不同浓度的硒(2、4和8 μM)预孵后建立感染模型。胞内感染3 h后,采用Western blot检测自噬相关蛋白的表达,通过自噬体和溶酶体的共定位检测,观察自噬流通畅程度;胞内感染1、2、3和4 h后,通过胞内细菌载量检测BMECs中S.aureus的增殖情况。结果显示:与S.aureu组相比,4和8 μM硒预处理组中LC3蛋白水平呈现显著或极显著下降(p<0.05或p<0.01);p62蛋白水平极显著降低(p<0.01)。与空白组相比,硒和S.aureus共处理组中,细胞内呈现更多的绿色荧光聚点;与S.aureus组相比,硒处理组溶酶体与LC3共定位明显。各硒处理组中胞内S.aureus的数量均显著或极显著(p<0.05或p<0.01)低于S.aurus组,结果呈剂量依赖性。综上所述S.aureus感染BMECs能诱导细胞发生自噬,但是自噬体和溶酶体无法正常融合,自噬流受阻。在S.aureus感染BMECs过程中,积累的未降解自噬体有助于S.aureus在BMECs中的存活;当自噬体形成受阻时,S.aures的胞内增殖会下降。硒能够促进自噬体和溶酶体的结合,改善自噬流的通畅程度,降低S.aureus在BMECs中的增殖,从而参与调节和改善S.aureus感染BMECs的进程。本试验结果为临床S.aureus性乳腺炎的预防和治疗提供了新思路。