论文部分内容阅读
生物被膜是大量细菌黏附聚集而形成的结构化群落,其具有良好的自我再生、可持续和可扩展等优势,在生物催化领域存在巨大的应用潜力。然而,生物被膜生长慢、产量低等瓶颈问题限制了其在生物催化中的应用。由此,本文通过外源添加群体感应系统活化因子硼强化生物被膜形成,进一步构建关键基因的过表达菌株解析生物被膜的内源调控机制,辅以载体改性技术提高生物被膜产量,并将其用于生物催化水解桑树黄酮苷芦丁合成天然产物异槲皮苷。主要研究结果如下:（1）外源添加硼衍生物调控群体感应系统,促进重组大肠杆菌生物被膜的形成。考察硼衍生物对群体感应信号分子AI-2活性、EPS含量和生物被膜产量的影响,建立AI-2活性与EPS含量的线性关系,并分析相关基因表达水平变化。结果表明,硼衍生物对AI-2活性的促进作用表现为硼酸＞偏硼酸钠＞过硼酸钠＞四硼酸钠＞四硼酸铵＞四硼酸钾＞氧化硼;其中,0.6 mmol/L的硼酸对生物被膜的促进效果最好,比对照组增加了88.54%。同时,在0-0.6 mmol/L浓度的硼酸和硼酸钠作用下,细菌中AI-2活性与EPS中的多糖和蛋白质含量均呈线性相关（r＞0.9）。实时荧光定量PCR结果显示,添加硼酸使大肠杆菌中EPS分泌基因、群体感应基因和细菌运动基因的表达量显著上调（p＜0.05）。上述结果表明,硼衍生物通过影响群体感应相关基因的表达,从而促进信号分子AI-2活性,增加EPS的分泌,强化了生物被膜的形成。（2）构建生物被膜形成关键基因过表达菌株,通过内源调控强化大肠杆菌的成膜能力。分别构建EPS分泌基因（rfa P、wza、pga A和bcs A）、群体感应基因（lux S、lsr B和aph A）和细菌运动基因（mot B、csg D和fim C）的过表达菌株,考察菌株的生物被膜产量、EPS含量、AI-2活性、运动性能及基因表达量变化。结果表明,10株过表达菌株中,lux S过表达菌株（E.coli rha B1-OE-lux S）和csg D过表达菌株（E.coli rha B1-OE-csg D）生物被膜产量分别比原始菌株显著增加了43.24%和79.35%,同时E.coli rha B1-OE-lux S和E.coli rha B1-OE-csg D的AI-2活性、EPS含量及细菌运动能力显著增强（p＜0.05）。实时荧光定量PCR结果显示,E.coli rha B1-OE-lux S中lsr B、wza、pga A和bcs A、mot B和fim C基因显著上调,E.coli rha B1-OE-csg D中lux S、lsr B、wza、pga A和bcs A、mot B和fim C基因显著上调。上述结果表明,通过在大肠杆菌中过表达lux S和csg D可增强生物被膜的形成、EPS分泌、细菌运动、群体感应调控能力,实现了从内源调控菌株的成膜能力提升,有利于其后续的催化应用研究。（3）通过对聚氨酯纤维载体表面亲水改性,提高大肠杆菌吸附量和生物被膜挂膜量。采用化学改性试剂对聚氨酯纤维载体作亲水表面改性,测定细菌附着量、挂膜量和载体催化剂的重复利用度,并利用扫描电镜与荧光倒置显微镜表征载体表面生物被膜的结构。结果表明,盐酸、硝酸和重铬酸钾改性显著提高了载体表面细菌吸附量,其最佳改性浓度分别为15%、20%和7%,此条件下细菌吸附量为1.91×10~8cfu/cm~3、2.17×10~8cfu/cm~3和1.12×10~9cfu/cm~3,分别为对照组的1.50倍、1.82倍和8.75倍。其中,经7%重铬酸钾改性的载体表面生物被膜最大挂膜量为1.42 g/g载体,是对照组的2.06倍。此外,改性载体培植的生物被膜催化剂,经2次循环使用后,酶活力仍保持在70%以上。上述结果表明重铬酸钾改性聚氨酯纤维载体表面有效增加了生物被膜产量,为其高效生物催化提供了细胞固定化载体支持。（4）群体感应调控与载体改性双向强化生物被膜催化桑树黄酮苷芦丁转化异槲皮苷。以改性聚氨酯纤维为生物被膜载体,分别考察了外源添加硼、内源过表达基因对生物被膜催化性能的影响。结果表明,硼强化培养的原始菌株生物被膜催化得率为55.80%,比对照组提高了32.76%;过表达菌株E.coli rha B1-OE-lux S和E.coli rha B1-OE-csg D生物被膜催化得率为67.24%和59.14%,比对照组提高了40.68%和66.24%。当p H值为6.0、温度为35℃、底物浓度为0.05 g/L时,E.coli rha B1-OE-lux S和E.coli rha B1-OE-csg D生物被膜催化合成异槲皮苷的时空产率分别为11.12 mg/m~3/h和9.48 mg/m~3/h,是原始菌株的1.6倍和1.36倍。同时,使用E.coli rha B1-OE-csg D菌株与改性聚氨酯纤维载体双向强化培养的生物被膜催化效率为67.24%,相较于野生菌株不添加载体条件下形成的生物被膜催化剂效率提高了247.85%,并且双向强化培养形成生物被膜重复催化3次后仍然高于原始菌株生物被膜,表明群体感应调控与载体改性双向强化培养的生物被膜催化剂具有更好的催化性能。综上,本文一方面通过外源添加硼衍生物以及内源过表达生物被膜形成相关基因,强化了重组大肠杆菌的成膜能力;另一方面对聚氨酯纤维载体表面亲水改性以提高菌株吸附量和挂膜量,从细胞和载体两个方面强化生物被膜催化剂的产量与形成速度,并将其用于催化水解芦丁合成异槲皮苷的应用中,为生物被膜催化桑树黄酮苷糖基定向改造提供了新的方法与技术。