结核分枝杆菌Wbl家族蛋白分析和WhiB3功能研究

来源 :中国科学院研究生院(武汉病毒研究所) | 被引量 : 2次 | 上传用户:dqqwa
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结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)在感染过程中可以根据外界环境变化选择进行激活感染或潜伏感染。在调控感染的过程中,Mtb各个生理过程的调控是必需的,其中转录调控在生理过程调控中发挥不可或缺的作用,而转录调控蛋白通过不同调控机制参与到转录调控过程。为探讨Mtb转录调控蛋白的调控机制,本论文围绕Wbl家族蛋白,特别是Whi B3的功能与调控机制开展研究,主要包括以下5方面的内容:1.结核分枝杆菌调控蛋白的系统分析。基于单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)抑制蛋白Mog R的抑制机理,构建了单体蛋白检测系统。Mog R蛋白包含N端的DNA结合结构域和C端的二聚化结构域。其中Mog R1-220能结合DNA,但不能抑制转录,基于此我们构建了将Mog R与调控蛋白融合的表达质粒。同时通过PCR将Mog R结合基序引入报告基因lac Z前的Ptac启动子中,得到报告质粒。系统构建后并对Mtb的调控蛋白进行了系统鉴定分析。154个调控蛋白中有109个可能是同源二聚体蛋白,32个可能为单体蛋白。在这些单体蛋白中,包括Wbl家族蛋白Whi B1-Whi B7。采用细菌双杂交系统检测Whi B1-Whi B7的自身相互作用,结果证明它们可能作为单体蛋白发挥调控功能。2.Wbl家族蛋白与σA相互作用的检测。通过蛋白共纯化、细菌双杂交和分枝杆菌蛋白互补等方法检测Wbl家族蛋白Whi B1-Whi B7与σA的相互作用,发现除Whi B5外都可以与σA相互结合。经过细菌双杂交系统和分枝杆菌蛋白互补系统检测,发现σA的R515位点影响与Whi B3、Whi B4、Whi B6和Whi B7的相互作用,而不能影响与Whi B1和Whi B2的相互作用。Whi B3在Mtb中发挥重要功能,以Whi B3为研究对象进行相互作用的进一步研究。采用细菌双杂交系统和蛋白共纯化分析,利用一系列突变体进行检测,发现σA的K508、P517和S518位点以及Whi B3的E81和E83会显著影响它们的相互作用。3.Mtb Whi B3的生理功能。在耻垢分枝杆菌(M.smegmatis,Ms)中过表达Mtb的Whi B3,不同生长期和缺氧条件取样,检测发现whi B3的转录在稳定期和缺氧时被诱导。在Ms野生型和Δwhi B3中诱导过表达Mtb的Whi B3后,表现为生长滞后、菌体加长和菌体沉降加快;而在σA的R515突变体菌株中,这些过表达效应消失。选取核糖体相关基因Msrps F和Msrps J为靶标进行研究,发现在稳定期添加诱导剂诱导Mtb的Whi B3表达没有影响这两个基因的转录,同时在MsΔwhi B3中检测不到明显的转录变化,表明不同时期过表达Mtb Whi B3产生不同的调控效应。4.Whi B3调控MMAR3796-MMAR3800操纵子的转录。在海分枝杆菌(M.marinum,Mm)突变whi B3后影响菌体色素的产生、对红细胞的裂解和溴化乙锭(EB)摄取,其中色素的产生与脂类合成相关。进一步在WT和Δwhi B3中检测Mm脂类合成相关基因的转录,发现MMAR3796的转录受到明显调控。对整个操纵子基因的转录进行分析,发现该操纵子的5个基因均受到Whi B3的调控。5.酸性环境下whi B3转录激活调控机制。通过对whi B3的启动子(whi B3p)分析和体外EMSA实验,确定Pho P可以特异性结合whi B3p。回复Mm的pho P和whi B3双基因突变体,发现在酸性条件下Pho P被磷酸化后调控whi B3的转录。以耻垢分枝杆菌pho PR和whi B3双突变体为背景进行不同回复实验,发现酸性条件下whi B3的转录激活需要Pho R和Pho P的磷酸化过程。
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