糖胺聚糖（Glycosaminoglycans,GAGs）是一类由己糖醛酸（Hexuronic acid,HexUA）和己糖胺（N-acetyl-hexosamine,HexNAc）组成的二糖单位重复连接而成的线性多糖,其结构复杂,常作为蛋白聚糖的侧链分布于细胞质基质及细胞表面。硫酸软骨素/硫酸皮肤素（Chondroitin Sulfate/Dermaton Sulfate,CS/DS）和肝素/硫酸乙酰肝素（Heparin/Heparan Sulfate,Hep/HS）是两类重要的硫酸化GAGs,它们不仅是机体组织的重要结构物质,同时也参与调节组织细胞的一系列生物学功能。它们通过与生长因子、细胞因子和形态因子以及各种细胞受体和细胞外粘附分子的结合介导细胞间的信号转导,从而在哺乳动物的中枢神经系统发育、组织细胞创伤修复、形态发生、细胞分裂及凋亡等方面发挥关键作用。不同位置的硫酸化修饰导致糖链结构的复杂性及不均一性赋予了其多样的生物学活性。因此对GAGs糖链结构的解析和测序是研究GAGs结构与功能关系的必要手段。然而,糖链结构的高度复杂性,给这一领域的研究带来了极大的挑战。CS/DS硫酸酯酶能够专一性识别特定的糖链结构,选择性去除糖链中特定位置的硫酸根,是GAGs结构和功能研究的重要工具酶。不仅如此,CS/DS硫酸酯酶还是动物和微生物CS/DS降解代谢的关键酶。人体内CS/DS硫酸酯酶功能的异常往往导致体内硫酸化多糖的异常贮积从而引发一系列遗传疾病,而微生物CS/DS硫酸酯酶是环境中硫酸化动物多糖参与碳循环和硫循环所必需的。然而目前已经报道的CS/DS硫酸酯酶屈指可数,且酶学性质及底物降解模式研究不够深入。某些早年报道的此类硫酸酯酶如来自于Proteus vulgaris的N-乙酰半乳糖胺-4-O-硫酸酯酶及N-乙酰半乳糖胺-6-O-硫酸酯酶序列未在GenBank数据库中进行注释,基因序列尚不明确。同时,我们发现CS/DS硫酸酯酶疑似基因在数据库中进行检索后仅能显示其属于硫酸酯酶超家族,对于其具体所属的亚家族却得不到正确的指认及预测。并且,硫酸酯酶底物极其复杂,不仅包括结构多样的GAGs大家族,还包括硫代葡萄糖酸盐、硫酸胆碱、类固醇及糖脂等其他生物大分子。因此要从被预测为硫酸酯酶的序列中鉴定出针对GAGs上特定硫酸根的硫酸酯酶,需要逐一进行克隆表达再通过高效液相色谱进行检测,工作量较大宛若大海捞针。因此,本研究致力于通过寻找和鉴定更多的CS/DS硫酸酯酶,研究其底物特异性、酶学性质和底物催化模式,在进一步丰富CS/DS硫酸酯酶数据库的基础上,利用生物信息学手段建立对CS/DS硫酸酯酶基因进行准确预测和分类的方法,解决当前各种基因/蛋白数据库中对CS/DS硫酸酯酶不能准确预测和指认的问题。海洋是一个非常复杂的环境,海洋生物组织中所含GAGs的种类很多,很多具有特殊结构的GAGs均来自海洋生物,因此海洋环境中势必蕴藏着可以降解这些GAGs的微生物和相应的降解酶。通过唯一碳源筛选法,我们先后从海泥中筛选到 了两株 GAGs 降解菌Vibrio sp.FC509和Photobacterium sp.FC615,并从中鉴定了多个CS/DS降解酶。本文首先对来自Photobacterium sp.FC615的两个新型CS/DS硫酸酯酶△4,5-己糖醛酸-2-O-硫酸酯酶PB2SF和外切型N-乙酰半乳糖胺-4-O-硫酸酯酶exoPB4SF进行了鉴定和酶学特性研究,同时对外切型exoPB4SF和与其高度同源但表现出内切活性的endoVB4SF（来自Vibrio sp.FC509）进行了比较研究。其次,从海洋细菌Phoyobacterium damselae基因组中发现和鉴定了一个新型外切型N-乙酰半乳糖胺-6-O-硫酸酯酶exoPM6SF,并对其酶学性质及底物降解模式进行了分析。具体研究结果如下:（1）△4,5-己糖醛酸-2-O-硫酸酯酶PB2SF能够作用并去除CS/DS及Hep/HS上己糖醛酸的C-2位硫酸根,对其他部位的硫酸根没有作用,是一个专一性极强的硫酸酯酶。该酶的最适缓冲液为NaAc-HAc（pH 6.0）,最适反应温度40℃。通过同源建模的方法构建了 PB2SF的三维结构模型,并对其活性中心附近的氨基酸（Asp52,Asn113,Lys141,His143,His205 和 His310）进行了定点突变。突变体 N113A、K141A、K141H、H143A、H143K、H205A 和 H205K 酶活力非常微弱,而突变体H310A、H310K和D52A完全失活,说明活性位点附近的这六个氨基酸,特别是Asp52和His310,是催化过程中的关键氨基酸。三维结构模型显示,PB2SF的活性中心氨基酸同其它细菌和人类硫酸酯酶一样均是高度保守的,因此可以推断该CS/DS硫酸酯酶应与其它类型硫酸酯酶具有相似的硫酸根水解机制。（2）N-乙酰半乳糖胺-4-O-硫酸酯酶exoPB4SF专一性水解去除二糖单位中N-乙酰半乳糖胺上的C-4位硫酸根,该酶与endoVB4SF均在缓冲液NaH2PO4-Na2HPO4（pH 8.0）中,且反应温度30℃时发挥最大酶活力。exoPB4SF及endoVB4SF对六糖底物降解模式分析显示,exoPB4SF仅去除六糖还原端的C-4位硫酸根,即使在过量酶降解足够时间的情况下仍然不会作用于寡糖内部的硫酸根,是一个典型的外切型硫酸酯酶。因此,寡糖在经此酶作用后不必担心内部硫酸根的丢失,这一特性使其成为制备还原端不含C-4位硫酸根的特定结构寡糖的重要工具酶。而内切型硫酸酯酶endoVB4SF对六糖的降解却表现出一定的方向性,该酶优先从还原端开始,具有逐步向非还原端进行降解的趋势。exoPB4SF及endoVB4SF的蛋白一级序列同源性高达83%,但却表现出内外切两种截然不同的催化特性,为了进一步分析其底物降解机制,我们从蛋白三级结构方面对其进行了研究。经过多次结晶条件的摸索,最终在100mMHEPES（pH7.5）和20%（w/v）PEG 10000缓冲液中获得endoVB4SF晶体并解析了其三维结构,这是世界上首个报道的内切型CS/DS硫酸酯酶的蛋白晶体结构,分辨率为1.95 A。三维结构显示此酶活性中心的氨基酸是被氧化修饰过的带两个羟基的醛水合物,这一结构进一步说明了 CS/DS硫酸酯酶在硫酸根水解机制上与其它类型硫酸酯酶相同。此酶的催化中心腔形成一个长条状深沟,为多糖链的结合提供了空间条件。由于还没有筛选到衍射较好的exoPB4SF晶体,我们用同源建模的方法构建了其三维结构模型。并分别将endoVB4SF及exoPB4SF与其底物进行了分子对接,研究其底物结合模式。分子对接计算结果显示endoVB4SF可以很好的对接其底物二糖及六糖,而exoPB4SF仅能与二糖完成对接,尽管exoPB4SF能降解六糖还原端的一个硫酸根,但六糖单元无法整体的对接入其催化腔,这一结果进一步说明exoPB4SF无法对六糖内部硫酸根进行降解的原因可能是空间位阻效应导致六糖内部的硫酸根无法进入到催化中心。对exoPB4SF及endoVB4SF三维结构进行比对后,我们发现尽管endoVB4SF与exoPB4SF催化位点附近的氨基酸是保守的,但它们的氨基酸侧链走向以及位于催化腔外侧的不规则卷曲有所差异,基于以上结果我们推断影响endoVB4SF及exoPB4SF对底物糖链长度选择性的关键因素是其糖链的结合能力,exoPB4SF的空间位阻效应及电荷效应使其无法结合较长的糖链从而无法水解糖链内部的硫酸根,而endoVB4SF的活性中心催化腔的三维结构使其可以容纳较长的糖链从而可以水解糖链内部的硫酸根。（3）7N-乙酰半乳糖胺-6-O-硫酸酯酶exoPM6SF专一性水解去除二糖单位中N-乙酰半乳糖胺上的C-6位硫酸根,该酶的最适缓冲液为NaAc-HAc（pH 6.0）,最适反应温度30℃。exoPM6SF是继Proteus 之后第二个报道的来自于细菌且作用于二糖的N-乙酰半乳糖胺-6-O-硫酸酯酶。值得注意的是,由于来源于Proteus vulgaris的N-乙酰半乳糖胺-6-O-硫酸酯酶的基因一直未被鉴定,因此在序列搜索中无法提供参照性。而exoPM6SF的报道填补了这一空白,为以后N-乙酰半乳糖胺-6-O-硫酸酯酶的研究奠定了基础。在对以上硫酸酯酶进行功能研究的同时,我们对已鉴定CS/DS硫酸酯酶蛋白的一级序列进行了研究。由于来自Proteus vulgaris的N-乙酰半乳糖胺-4-O-硫酸酯酶及6-O-硫酸酯酶酶学性质及底物降解模式均已被报道,但其基因序列在数据库中至今未有对该酶的明确注释,为研究其基因序列,我们首次克隆表达了Proteus vulgaris菌株中的硫酸酯酶序列并进行了活性验证,最终确定了来自该菌的4-O-硫酸酯酶及6-O-硫酸酯酶的基因序列。对所有已经鉴定的细菌来源CS/DS硫酸酯酶进行序列比对后,结果显示具有特定底物专一性的CS/DS硫酸酯酶分别具有序列保守区域。本文报道了 △4,5-己糖醛酸-2-O-硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺-4-O-硫酸酯酶及N-乙酰半乳糖胺-6-O-硫酸酯酶的标签序列。并通过标签序列鉴定了三个分别来自Vibrio sp.FC509,Yersiniapseudotuberculosis和Salmonella enterica的新型CS/DS硫酸酯酶。标签序列的报道解决了 CS/DS硫酸酯酶在数据库中无法正确指认的问题,使未知功能的此类硫酸酯酶可以直接通过标签序列进行预测,不必再通过对海量硫酸酯酶序列逐一克隆表达寻找针对硫酸软骨素及硫酸皮肤素的硫酸酯酶,简化了以往复杂的验证流程,大大提高了 CS/DS硫酸酯酶的鉴定效率。与此同时,我们将分析得到的三类硫酸酯酶的一级标签序列在蛋白三级结构中的位置进行了对照分析,发现标签序列大多位于蛋白三级结构活性中心催化腔外侧的不规则卷曲上,由此推断这些标签序列是影响硫酸酯酶底物结合的关键序列,它们虽然在蛋白一级结构上相对分散,但在蛋白折叠后的三维结构中相对集中,共同发挥作用,影响硫酸酯酶对底物的结合。综上所述,本论文从蛋白的一级序列到三级结构对CS/DS硫酸酯酶进行了系统研究,对三种不同类型的CS/DS硫酸酯酶进行了酶学性质及底物降解模式分析,首次报道了不同类型CS/DS硫酸酯酶的标签序列,并根据标签序列鉴定了多个新型CS/DS硫酸酯酶,解决了此类硫酸酯酶无法被正确预测及分类的问题。丰富了 CS/DS硫酸酯酶序列数据库,有力推进了 GAGs工具酶的挖掘及其构效关系的相关研究。