胃癌是严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤,在我国其发病率和死亡率均居所有恶性肿瘤的第二位。近年来大量研究结果显示,肿瘤干细胞(Cancer Stem Cells, CSC)在肿瘤的复发转移中发挥着重要的作用,靶向CSC的治疗为肿瘤临床治疗提供了新的策略。大量报道证实无血清悬浮培养中CSC可以形成特殊的sphere,并可富集CSC。我们首先采用无血清悬浮培养结合PKH26染色证明了人胃癌细胞系SNU-5中确实存在可以形成sphere的GO期肿瘤细胞；分析SNU-5亲本及sphere细胞的顺铂耐药性,发现sphere细胞具有更强的耐药性,其IC50值是亲本细胞的3.2倍(0.086μg/ml vs0.027μg/ml);采用流式细胞术检测SNU-5亲本及sphere细胞中CSC标志物的表达,结果显示CD90+细胞的比例富集了6倍(1.3%vs7.9%)；sphere染色结果表明CD90可以与标示CSC的PKH26共染,初步证明了CD90可作为人胃癌细胞系SNU-5细胞的CSC标志物。进一步,我们检测了SNU-5的CD90+细胞的各项CSC特征。采用免疫流式荧光分选SNU-5,结果显示CD90+细胞的自我更新能力显著高于CD90-细胞(CD90+细胞成球率7.7%±1.1%vs CD90-细胞成球率1.3%±0.4%)；侵袭能力显著增强[CD90+细胞(283.3±30.2)个/视野vs CD90-细胞(48.0±7.5)个/视野]；在SCID鼠体内致瘤性显著增强(皮下接种2×102个CD90+细胞6周致瘤1/6vs接种2×104个CD90"细胞10周致瘤1/6)。以上这些结果证明了CD90是SNU-5细胞系的CSC标志物之一。为了初步明确CD90作为人胃癌CSC标志物在临床患者肿瘤组织中的表达情况,我们随后采用从人胃癌患者新鲜肿瘤组织中分离获得的活细胞,以细胞流式荧光及免疫荧光检测了胃癌实体瘤组织分离获得的原代培养细胞中的CSC标志物的表达,结果发现CD90在所有人胃癌中均有不同程度的表达(0.6%～3.9%,n=7)。进一步我们采用免疫组化的方法研究了CD90在95例临床组织中的表达情况,分析发现CD90的表达与胃癌患者的转移和预后密切相关。这些结果提示了CD90也可能是临床胃癌患者CSC的标志物之一,CD90+胃癌干细胞可能在临床患者胃癌的发展、转移中发挥了重要的作用。为制备抗人胃癌CSC的单克隆抗体药物,我们在前期已用多例含有人胃癌sphere细胞和人胃癌组织中的癌细胞免疫了小鼠,采用杂交瘤技术制备了含有1370个杂交瘤克隆的人胃癌单抗库。进一步我们采用SNU-5的sphere细胞从中最终筛选获得6株可能识别人胃癌CSC的单抗,选取其中两株(15D2和9A9)进行深入研究。结果发现,单抗15D2可识别34.8%的SNU-5的CD90+胃癌干细胞,其所识别的抗原表达于细胞胞浆及胞膜,膜表达15D2靶抗原的细胞能被无血清悬浮培养的方法富集(5.1%vs12.3%)；同时,15D2也是一株功能性单抗,能抑制SNU-5sphere细胞的增殖(抑制率22.1%)、侵袭(抑制率22.4%)以及自我更新(抑制率27.2%)。裸鼠体内抗体治疗及联合化疗实验结果显示,15D2单抗单独使用可以抑制胃癌移植瘤的生长(低、中、高剂量的抑制率分别为8.2%、31.1%、38.2%),且存在剂量依赖关系；15D2联合化疗药的治疗方案治疗效果最佳(抑制率为60.2%),不仅可以有效抑制移植瘤的生长,还能抑制由于化疗药引起的肿瘤的复发,显示出较大的优势,为肿瘤干细胞的靶向治疗提供了新的思路和候选前体药物。分离15D2识别的靶抗原进行质谱鉴定,靶抗原为A,有文献报道其与肿瘤的侵袭相关。采用靶抗原A的商业化抗体进行免疫荧光共聚焦的共定位研究,初步验证了该抗原确实是15D2单抗识别的靶抗原,其他验证工作正在进行中。单抗9A9可识别25.8%的CD90+胃癌干细胞,识别的抗原绝大多数存在于胞膜上,膜表达9A9靶抗原的细胞能被无血清悬浮培养的方法富集(2.2%vs6.9%)；9A9单抗对SNU-5sphere细胞增殖抑制率为26.1%,侵袭抑制率为23.2%,成球抑制率为37.3%,9A9识别的抗原为130KD大小的膜蛋白。单抗9A9也有潜力成为候选肿瘤干细胞靶向治疗前体药物。综上所述,本研究证实了CD90是人胃癌细胞系SNU-5的CSC标志物,并与临床胃癌患者的转移和预后相关；筛选获得了2株可较特异性靶向CD90+胃癌干细胞的单抗,证明了它们具有抑制人胃癌CSC自我更新和增殖的功能,鉴定了其中1株抗胃癌CSC单抗的靶抗原,为胃癌干细胞的靶向治疗提供了潜在的治疗靶点以及新的候选治疗药物。