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华北大黑鳃金龟(Holotrichia oblita Faldermann)隶属鞘翅目,鳃金龟科,其幼虫蛴螬,是花生、大豆、小麦、玉米、马铃薯等作物的重要地下害虫,危害严重,防治困难。采用“地下害虫,地上防治”、“防治成虫,控制幼虫”的策略,寻找一种高效、无污染的华北大黑鳃金龟成虫防治新途径已成为当务之急,其中利用寄主植物的挥发物诱杀成虫是目前华北大黑鳃金龟防治的一种潜在绿色防控技术。本文以阐明其成虫触角中两种气味结合蛋白(HoblOBP1和HoblOBP2)的互作能增强对气味化合物的结合能力为目标;通过荧光原位杂交技术证明了HoblOBP1和HoblOBP2在成虫触角中的共表达;利用蛋白分子对接技术对两蛋白的结合模式及其两蛋白复合物与气味分子的关键结合位点进行预测与分析;采用定点突变技术,获得特定的突变基因,进而表达纯化以获得不同的突变蛋白;通过荧光结合实验明确不同结合位点在HoblOBP1/OBP2复合物识别活性气味分子中的影响,从而解析OBPs异源二聚体的形成机制及其对气味分子的识别机制。主要研究结果如下:1.荧光原位杂交实验表明HoblOBP1和HoblOBP2在华北大黑鳃金龟的触角感器中共表达。2.HoblOBP1和HoblOBP2对接后,构建了HoblOBP1/OBP2复合物的三维结构模型。研究发现HoblOBP1、HoblOBP2和HoblOBP1/OBP2的结合口袋分别由68、77和79个氨基酸残基组成。尤为重要的是,HoblOBP1/OBP2复合物的结合口袋明显大于任一单一蛋白的结合口袋,其主要由HoblOBP2提供,HoblOBP1仅提供了一部分。3.在HoblOBP1和HoblOBP2构建的蛋白复合物的结合口袋分析中,发现HoblOBP1的三个氨基酸残基Asp61、Gly85和Ile87分别与HoblOBP2的Tyr86、Ile75和Asn74相互作用形成了3对氢键。本实验通过单点突变(HoblOBP1中的Gly85,HoblOBP2中的Asn74和Tyr86)和双点突变(HoblOBP2中的Asn74和Tyr86)的方式来实现两个蛋白间的一对、两对或三对氢键的断裂。荧光结合实验结果表明3对氢键均断裂后,其与探针1-NPN的结合曲线和Scatchard方程分别呈现上升趋势和线性相关,蛋白混合物与反-2-己烯醇、1-庚醛、R-(-)-芳樟醇和α-松油醇完全不能结合。当断裂1对或2对氢键时,所有的蛋白混合物与1-NPN的结合曲线和Scatchard方程分别表现下降趋势和“J”形状的向下凹的曲线,带有HoblOBP1上G85A突变位点的蛋白混合物与化合物仍有较弱的结合能力。由此表明三对氢键均对蛋白复合物与化合物结合产生影响,但与HoblOBP2-Tyr86/Hobl OBP1-Asp61和HoblOBP2-Asn74/HoblOBP1-Ile87这两对氢键相比,HoblOBP1-Gly85/HoblOBP2-Ile75的影响较小。4.在蛋白复合物与四种配体对接分析中,发现HoblOBP2中的Asn54、Thr71、Asn74、Leu126和Asn127等氨基酸残基均参与了蛋白与配体间氢键的形成。此外,配体分子周围存在的疏水残基参与了配体和蛋白的结合作用,这些疏水残基主要有HoblOBP1中的Val86,HoblOBP2中的Leu59和Met117。对HoblOBP2中的5个氢键形成的位点(Asn54,Thr71,Asn74,Leu126和Asn127)和HoblOBP1中的1个疏水位点(Val86)进行单点突变;对蛋白复合物与反-2-己烯醇结合的双氢键位点(HoblOBP2中的Leu126和Asn127),以及与α-松油醇结合的双氢键位点(HoblOBP2中的Thr71和Asn74)进行双点突变。荧光结合实验结果表明5个氢键形成位点分别突变成丙氨酸后,蛋白混合物与化合物结合能力显著减弱;疏水位点突变后,二者之间仍存在一定的亲和性;由此说明蛋白与配体间的疏水键对两者之间的结合作用的影响弱于氢键。双点突变后,蛋白混合物对化合物完全不能结合;另外,所有突变蛋白混合物与与1-NPN的结合曲线和Scatchard方程分别表现下降趋势和“J”形状的向下凹的曲线。本文解析了华北大黑鳃金龟HoblOBP1和HoblOBP2异源二聚体对气味分子的识别机制,其中两个蛋白之间形成的3对氢键是HoblOBP1与HoblOBP2能够形成异源二聚体的关键作用力,同时显著影响蛋白复合物对化合物结合能力。蛋白复合物与4种化合物之间形成的氢键作用是其与化合物能够结合的关键因素,形成氢键作用的5个氨基酸位点为蛋白复合物识别活性气味分子的关键结合位点。本研究结果不仅有助于揭示华北大黑鳃金龟对寄主植物嗅觉识别的分子机理,对开发成虫行为调控措施也具有重要的指导意义。