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第一代转基因抗虫棉的商业化种植从1996年至今已经超过了15年,为了延缓靶标害虫的抗性发展,两种或两种以上不同作用模式的Bt毒素基因被同时转入作物中的第二代基因叠加转基因棉花于2003年后推广种植。应用最广泛的第二代抗虫棉同时表达Cry1Ac和Cry2Ab两种毒素,但在我国尚未种植这种双价抗虫棉。当前对Bt毒素抗性的研究主要集中在Cry1A毒素上,对Cry2A毒素作用方式的研究还十分有限。本文通过对我国华北和西北两个主要棉花产区14个地点田间棉铃虫种群进行Cry2Ab敏感性测定,建立了敏感基线；比较Cry1Ac和Cry2Ab毒素与棉铃虫抗性和敏感品系中肠BBMV蛋白结合特征和交互作用；通过蛋白质组学技术,分离和鉴定棉铃虫中肠BBMV上Cry2Ab的主要结合蛋白,并测定了棉铃虫中肠液全蛋白。本文的研究结果将为棉铃虫Cry2Ab敏感性监测和Cry2Ab抗性机理研究奠定重要基础。1.棉铃虫Cry2Ab毒素敏感基线的建立2010年棉铃虫对Cry2Ab毒素的敏感性监测数据结果显示：棉铃虫田间种群的LC50值分布在22-170ng/cm2之间,地区差异在10倍以内。田间种群对Cry2Ab毒素和对CrylAc毒素敏感程度没有明显相关性。在监测的全部14个地区,棉铃虫田间种群对Cry2Ab毒素敏感程度无明显差异,说明第二代抗虫棉可以在我国推广种植并可望取得好的防效。2. Cry2Ab与棉铃虫Cry2Ab抗性和敏感品系中肠BBMV配基结合的比较以生物素标记的Cry2Ab毒素和棉铃虫中肠BBMV蛋白进行配基结合实验,发现存在76、62、49、40、38、33kDa共6个结合条带,在抗性品系中条带76kDa和49kDa结合能力有明显下降。在加入200倍未标记的Cry2Ab毒素进行同源竞争,所有条带信号明显减弱,说明这些条带所在蛋白与Cry2Ab毒素结合具有饱和效应,其结合能力下降可能是导致抗性的原因。对比Cry1Ac和Cry2Ab配基结合结果发现,Cry1Ac结合蛋白至少超过9种,在分子量从30到200kDa都有分布。与Cry1Ac结合的Cadherin条带未在Cry2Ab的结合条带中发现。在异源毒素竞争结合中,在200倍Cry2Ab毒素竞争条件下,几乎对Cry1Ac的结合毫无影响；而200倍的Cry1Ac毒素的竞争条件下,足以取代所有Cry2Ab毒素,说明Cry2Ab毒素的结合方式和结合能力与CrylAc毒素有很大差异。3.棉铃虫中肠Cry2Ab结合蛋白和中肠液蛋白的分离和鉴定通过2-DE、配基结合和质谱鉴定相结合,分离和鉴定到32个Cry2Ab毒素的主要结合蛋白,分子量集中在30kDa到120kDa。在所鉴定的蛋白中有3种膜蛋白,分别是氨肽酶APN5、ATP/ADP转运蛋白和膜联蛋白IX。其中APN、ATP/ADP转运蛋白具备CrylA毒素结合能力在先前研究中已有报道,而annexin IX在Cry2Ab毒素作用模式中的作用仍有待进一步研究。此外,结合蛋白中还有大量代谢、细胞信号调控相关蛋白,它们结合的特异性以及是否参与毒素作用尚不得而知。同时为了对Cry2Ab毒素在中肠中消化方式有更深刻的了解,本实验分离和鉴定了棉铃虫中肠液蛋白,鉴定出33种中肠液蛋白,其中消化类蛋白酶10种,非蛋白酶类消化酶共有16种,其它蛋白7种。