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日本乙型脑炎（Japanese Encephalitis，JE）是由日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的一种人畜共患自然疫源性疾病。JEV属于黄病毒科黄病毒属，是单股正链RNA病毒，基因组编码一个多聚前体蛋白，成熟切割后可形成3个结构蛋白(核衣壳蛋白C、膜蛋白M、囊膜蛋白E)及7个非结构蛋白。其中，E蛋白和NS1蛋白是JEV的重要蛋白，在保护性免疫及防制病毒感染中起着重要作用。
NF-κB是一种重要的转录因子，可启动大量与免疫应答和炎症反应相关基因的转录，同时也影响着细胞的生长、分化、凋亡、癌变和个体发育等，与多种生理、病理过程及疾病的发生发展关系密切。对许多病毒来说，NF-κB信号通路是有效的作用靶点，通过影响NF-κB的活化，逃避宿主的免疫系统而发挥对感染细胞的致病作用。因此，研究JEV或病毒蛋白与NF-κB信号通路的关系将有助于我们从分子水平上揭示JEV可能的致病机制，为JE的防治提供一定的理论依据。
本研究以本实验室保存的JEV GZ0904-31(JEGZ)株为研究对象，根据GenBank中注册的疫苗株SA14-14-2 E基因与NS1基因的核苷酸序列设计合成了2对引物，通过RT-PCR方法成功扩增出含有目的基因的DNA片段，并将其克隆到pMD18-T载体中进行序列测定，利用DNAStar和MEGA4.0分析软件对GZ0904-31株E基因与NS1基因的核苷酸序列进行分析，并以E基因与NS1基因为基础构建进化树，对GZ0904-31株进行分子遗传进化分析。结果显示，GZ0904-31株与JEV GⅢ型相似性高于其他基因型；进化关系分析同样表明，该毒株与GⅢ型JEV毒株的的遗传关系较近，在进化树上属同一分支，因此，GZ0904-31株属于JEV GⅢ型。核苷酸序列及推导的氨基酸序列差异度分析发现，GZ0904-31株E基因与野毒株SA14相应序列存在28个核苷酸、1个氨基酸不一致，与疫苗株SA14-14-2相应序列存在37个核苷酸、11个氨基酸不一致；NS1基因与野毒株SA14相应序列存在25个核苷酸、3个氨基酸不一致；与疫苗株SA14-14-2相应序列存在30个核苷酸、6个氨基酸不一致。分析发现，GZ0904-31株与野毒株SA14的亲缘关系较近，属于强毒株，可用于疫苗株的研发与筛选。
将E基因和NS1基因分别克隆到真核表达载体pEGFP-N1中，构建了重组表达质粒pEGFP-N1-E与pEGFP-N1-NS1，通过PCR检测、酶切和测序分析进行鉴定，证实E基因与NS1基因正确插入pEGFP-N1载体中。用脂质体转染法分别将重组质粒pEGFP-N1-E与pEGFP-N1-NS1转染猪肾(PK-15)细胞，检测蛋白表达情况，结果显示，转染细胞中有绿色荧光蛋白表达，Western blot分析显示重组质粒pEGFP-N1-E与pEGFP-N1-NS1所表达的蛋白大小分别约为80kDa与70kDa。
证实了GZ0904-31株E、NS1蛋白各自在PK-15细胞中得到表达后，我们研究了病毒及表达蛋白对PK-15细胞NF-κB信号通路的影响。本研究采用电泳迁移率变动实验(EMSA)分析了NF-κB是否入核，采用Western blot方法检测不同时间点p65和IκBα两种NF-κB相关因子的表达情况。结果显示，GZ0904-31株及其E、NS1蛋白作用PK-15细胞后，在细胞的核蛋白提取物中检测不到特异的DNA结合条带，表明NF-κB没有入核；细胞质中p65和IκBα两种蛋白的表达也无明显变化，进一步提示，GZ0904-31株及其E、NS1蛋白不能诱导PK-15细胞NF-κB的活化。