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人类iNOS基因启动子-1026C／A多态的功能研究前言一氧化氮合酶包括：神经型一氧化氮合酶(nNOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS).其中,iNOS在正常生理状态下不表达或表达量极低,只有诱导后才大量表达,因此iNOS基因表达调控对NO的产生至关重要。iNOS基因在原发性高血压发生中发挥重要作用,一方面iNOS可通过产生NO引起血管平滑肌细胞舒张降低血压,另一方面还通过NO衍生物一过氧亚硝酸盐阴离子(ONOO-)发挥促高血压作用。本课题组前期研究中,通过高血压高发区连锁分析发现17号染色体上的微卫星D17S1878与高血压存在连锁。进一步病例-对照人群和家系研究证实,iNOS基因启动子-1026C／A多态与高血压发生相关,其中-1026C等位基因及-1026CC基因型是高血压发生的独立危险因素。此外对iNOS启动子-1026C／A多态的初步功能研究发现,-1026位点存在转录因子YY1反应元件,-1026C／A多态影响了YY1-DNA结合模式以及iNOS启动子萤光素酶报告基因重组体p1173C/A-luc的转录活性,并推测可能继而通过影响NO的产生导致-1026C／C的高血压易感风险升高。然而,YY1是如何影响iNOS启动子,-1026C／A多态对iNOS基因转录的确切功能,以及多种高血压相关因子调控iNOS转录活性的效应和具体机制尚不明确。材料与方法一、实验材料1、细胞系：人喉鳞癌细胞(Hep2),人胃癌细胞(BGC823),非洲绿猴肾(COS-7),小鼠巨噬细胞(RAW264.7)；2、载体：萤火虫荧光素酶报告载体、海肾荧光素酶表达载体、YY1表达及RNA干扰载体、NFIC野生型及突变型表达载体、c-Jun表达载体、雌激素受体表达载体、糖皮质激素受体表达载体、盐皮质激素受体表达载体、p300野生型及突变型表达载体；3、Western印迹杂交相关试剂及试剂盒；4、基因克隆及萤光素酶报告基因检测相关试剂及试剂盒；5、DNA-蛋白质结合实验、免疫共沉淀、电泳泳动迁移实验(EMSA)及染色质免疫沉淀(ChIP)相关试剂及试剂盒；6、Real-time PCR相关试剂及试剂盒；7、细胞刺激因子：细胞因子混合物(IFN-y、IL-1p和TNF-a)、丁酸钠、雌二醇、地塞米松、醛固酮、转化生长因子-β1、胰岛素样生长因子Ⅱ和胰岛素。二、实验方法1, iNOS启动子萤光素酶报告基因载体构建及检测：利用在线软件进行iNOS启动子转录因子预测分析,构建系列截短的萤光素酶报告基因重组体,应用双荧光素酶检测系统检测启动子的活性,鉴定iNOS基因关键转录调控区；2、应用DNA-蛋白质结合实验、免疫共沉淀、EMSA和ChIP方法鉴定iNOS启动子-1026C／A多态位点DNA-蛋白质复合物组成,各转录因子相互作用,及DNA-结合亲和力；3、共转染转录因子及激素受体表达载体,应用萤光素酶报告基因系统,检测YY1、NFI和AP-1对iNOS基础启动子活性的影响；以及雌二醇、地塞米松、醛固酮、转化生长因子-β1、胰岛素样生长因子Ⅱ和胰岛素在iNOS转录调控中的作用；4、Real-time PCR方法检测YY1、NFI和AP-1过表达对细胞因子混合物诱导后iNOSmRNA表达的影响；5、丁酸钠刺激,以及共转染野生型／突变型p300表达载体,检测乙酰化在iNOS表达调控中的作用。结果1、系列截短的萤光素酶报告基因活性检测发现iNOS启动子-1173bp～-1032bp的141-bp片段可能为负性转录调控区；含有-1026C／A多态位点的16-bp片段(-1032 bp～-1016 bp)为iNOS基因转录的关键正性调控区。2、转录因子预测分析发现,除YY1外,iNOS启动子-1026C／A位点还存在另两个转录因子NFI和AP-1,DNA-蛋白质结合实验显示,-1026C／A位点存在由YY1,NFI和AP-1组成的蛋白质复合物,其中YY1与-1026C优势结合,而NFI与-1026A优势结合,免疫共沉淀结果提示AP-1和NFI之间存在相互作用,NFI和YY1之间也可能存在相互作用,而AP-1和YY1之间可能无直接的相互作用。3、EMSA实验证实NFI能与-1026A特异性直接结合,而AP-1与-1026A之间的结合可能是间接的,ChIP实验显示细胞内NFI和YY1与含有-1026C／A位点iNOS启动子结合,且YY1与-1026C结合亲和力较强,NFI与-1026A结合亲和力较强。4、通过YY1和NFI过表达及YY1的RNA干扰后检测p1173C/A-luc和p1032C/A-luc转录活性,发现YY1和NFI抑制iNOS基础启动子活性,该负性调控作用受正性转录调节因子AP-1的影响；其中,YY1的抑制作用明显强于NFI。5、Real-time PCR结果显示,细胞因子混合物(IFN-γ> IL-1β和TNF-α)显著诱导BGC823细胞iNOS表达,YY1、NFI或AP-1单独过表达对iNOS的诱导表达影响不明显,而AP-1/NF1或AP-1/YY1联合过表达均抑制iNOS的诱导表达,且AP-1/YY1的抑制作用明显强于AP-1/NF1。6、转录因子预测分析显示iNOS基因启动子1.2 kb序列中还存在一个TATA box、NF-κB/C/EBP、C/EBP、Spl以及多个糖皮质激素和雌激素反应元件；7、体外培养BGC823、Hep2、COS-7和RAW264.7细胞发现,p1173C/A-luc转录活性在不同细胞系中差异明显,而-1026C／A在不同细胞系中均影响iNOS启动子活性。8、类固醇激素(雌二醇、地塞米松、醛固酮)刺激及其受体过表达实验结果显示,雌激素下调p1173A-luc转录活性依赖于雌激素受体,醛固酮及盐皮质激素受体有上调p1173A-luc转录活性的趋势,而地塞米松及糖皮质激素受体对p1173A-luc转录活性无明显作用；此外,p1173C-luc转录活性不受这些激素的影响。9、应用去乙酰化酶抑制剂丁酸钠刺激,以及乙酰转移酶辅助因子p300的过表达实验,发现丁酸钠处理可显著降低p1173C-luc和p1173A-luc的转录活性,且对p1173A-luc的抑制作用较强；而共转染野生型p300后p1173C-luc和p1173A-luc转录活性无显著变化；提示由丁酸钠介导的乙酰化修饰可能抑制iNOS基因的基础启动子活性。10、应用血压调节因子(TGF-β1、IGFⅡ和胰岛素)处理Hep2细胞后p1173C／A-luc转录活性均无明显改变,-1026C／A多态的作用仍很显著,提示人iNOS基因1.2 kb启动子可能不是这些血压调节因子的直接作用靶点。结论1、iNOS启动子-1026C／A多态位点所在16-bp片段是基础转录活性的关键调控区,该位点DNA-蛋白质复合物包括YY1、NFI和AP-1,其中YY1和NFI直接结合DNA,而AP-1间接结合DNA；2、YY1和NFI与-1026C／A位点的结合亲和力存在差异,YY1与-1026C优势结合,NFI与-1026A优势结合；3、YY1和NFI均抑制iNOS基础启动子转录活性,且YY1的作用明显强于NFI,在细胞因子诱导后,AP-1/YY1对iNOS基因mRNA转录的抑制效应明显强于AP-1/NFI;4、iNOS基因启动子可能存在多个转录因子反应元件,其中的雌激素反应元件(ERE)可能在雌激素下调iNOS启动子转录活性中起重要作用；5、-1026C／A多态对iNOS启动子活性的影响在多种细胞系中趋势一致,但其作用效应存在一定的种属特异性；多种刺激因素也没有影响-1026C／A多态对转录调控作用的趋势；6、乙酰化修饰对iNOS基因转录调控发挥重要作用,特别是丁酸钠对iNOS启动子转录活性的明显抑制作用值得进一步研究。