【摘 要】
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目的:激活转录因子4（ATF4）是一种重要的DNA结合转录因子,其在膀胱肿瘤组织中存在异常表达。本研究通过免疫组织化学染色（IHC）、细胞体外功能实验和裸鼠成瘤实验,结合CRISPR/Cas9基因编辑技术和全转录组测序技术,探究ATF4在膀胱癌发生发展中的作用和潜在机制。方法:（1）利用免疫组化染色检测ATF4在膀胱癌组织中的表达水平。（2）通过蛋白免疫印迹验证细胞中ATF4敲除效果;利用MTT实
【基金项目】
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项目名称:SUMO化修饰影响膀胱癌的发生发展和化疗敏感性的研究，项目合同编号:81760454，项目来源:国家自然科学基金，项目起止时间:2018年01月-2021年12月； 项目名称:肝癌的三维基因组学，项目合同编号:2016GXNSFGA380006，项目来源:广西自然科学基金创新团队，项目起止时间:2016年09月1日-2020年08月31日；
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目的:激活转录因子4（ATF4）是一种重要的DNA结合转录因子,其在膀胱肿瘤组织中存在异常表达。本研究通过免疫组织化学染色（IHC）、细胞体外功能实验和裸鼠成瘤实验,结合CRISPR/Cas9基因编辑技术和全转录组测序技术,探究ATF4在膀胱癌发生发展中的作用和潜在机制。方法:（1）利用免疫组化染色检测ATF4在膀胱癌组织中的表达水平。（2）通过蛋白免疫印迹验证细胞中ATF4敲除效果;利用MTT实验、药物敏感实验和细胞凋亡实验检测T24和T24 ATF4-KO细胞系的生物学功能变化;通过裸鼠成瘤实验检测T24和T24 ATF4-KO细胞成瘤能力。（3）利用CRISPR/Cas9基因编辑技术及全转录组测序技术,筛选ATF4的协同致死基因,初步探讨ATF4及其协同致死基因对膀胱癌进展和预后的影响。结果:（1）免疫组化结果显示ATF4在膀胱癌组织的阳性率为92.47%,在膀胱癌旁组织中几乎不表达（P＜0.01）;ATF4蛋白表达水平与膀胱癌组织病理分级相关（P＜0.05）。（2）免疫印迹结果显示ATF4-KO细胞中ATF4敲除成功。（3）MTT实验和药物敏感实验显示,敲除ATF4后,T24细胞生长增值能力下降（P＜0.001）,对氯喹、二甲双胍和维替泊芬的药物敏感性增加（P＜0.05）,但是对顺铂的药物敏感性没有明显影响（P＞0.05）。（4）流式细胞术结果显示敲除ATF4基因后,促进了T24细胞晚期凋亡,且化疗药物作用后晚期凋亡增加（P＜0.05）,但对早期凋亡没有明显影响（P＞0.05）。（5）敲除ATF4基因后,T24细胞裸鼠成瘤能力降低。（6）通过CRISPR/Cas9基因编辑技术成功筛选出971个ATF4的潜在协同致死基因,这些基因主要富集在脂质代谢、基因转录调控和蛋白质合成等相关通路中,其中HMMR、KREMEN2和B4GALNT1基因与膀胱癌患者临床预后相关。结论:（1）ATF4在膀胱癌组织异常高表达。（2）敲除ATF4基因能抑制T24细胞的生长增值,促进细胞晚期凋亡,增加对氯喹、二甲双胍和维替泊芬的药物敏感性。（3）敲除ATF4基因可以抑制膀胱癌T24细胞裸鼠成瘤能力。（4）HMMR、KREMEN2和B4GALNT1基因可能是T24细胞中ATF4的协同致死基因,可影响膀胱癌临床预后。
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