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目的本研究主要目标是阐述穿心莲内酯（Andrographolide,Andro）通过促进活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的产生,从而引起脱氧核糖核酸（Deoxyribo nucleic acid,DNA）损伤发生以及细胞周期阻滞,并诱导p62聚集引起肝癌细胞死亡的作用;以细胞周期阻滞,p62及其下游因子为主要研究靶点,探索穿心莲内酯诱导肝癌细胞死亡的分子机制。为开发具有抗炎抗肿瘤效应的中草药单体提供实验依据,阐明分子机制,为将穿心莲内酯运用于肝癌治疗提供作用靶点。方法1.检测穿心莲内酯诱导肝癌细胞死亡:人肝细胞癌Hep G2细胞、Huh7细胞和HCCM细胞在体外不同时间点用不同浓度的穿心莲内酯处理。通过碘化丙啶（Propidium iodide,PI）染色利用流式细胞术检测细胞存活及死亡情况;采用MTT实验评估穿心莲内酯对肝癌细胞增殖的影响;使用普通光镜和Hoechst染色观察细胞形态的变化;用蛋白质印迹法（Western blot,WB）检测细胞死亡相关蛋白。2.检测穿心莲内酯对活性氧ROS产生及DNA损伤的影响:使用DCFH-DA（DCF）探针通过流式细胞术和荧光显微镜方法来检测活性氧ROS水平的变化。其次使用蛋白印迹法和共聚焦显微镜检测DNA损伤标志物（γ-H2AX）来评估DNA损伤的水平。并且联合N-Acetyl-L-cystine（抗氧化剂,NAC）进一步检测ROS产生与DNA损伤的先后因果关系以及ROS聚集所致的DNA损伤对于肝癌细胞死亡的影响。3.检测p53在穿心莲内酯诱导的细胞周期阻滞中的作用:采用流式细胞术和免疫印迹法检测细胞周期和细胞周期阻滞检查点相关蛋白;使用蛋白免疫印迹法检测p53的表达增加;利用人结肠癌p53野生型（HCT116-p53WT）以及p53敲除型（HCT116-p53KO）细胞,Pifithrin-αhydrobromide（p53抑制剂,PFT）模拟关键基因p53的突变及缺失,进一步证实p53对于周期阻滞的作用。4.检测抑制p53依赖性G2-M期周期阻滞后对穿心莲内酯诱导肝癌细胞死亡的影响:利用人结肠癌p53野生型（HCT116-p53WT）以及p53敲除型（HCT116-p53KO）细胞,或者联合使用AZD6738（ATR抑制剂）和SCH900776（CHK1抑制剂）后,使用流式细胞术和免疫印迹法检测穿心莲内酯所导致的肝癌细胞死亡情况,检测p53依赖性细胞周期阻滞在DNA损伤修复及诱导肝癌细胞死亡中的作用。5.检测穿心莲内酯通过ROS促进p62积累,从而对诱导肝癌细胞死亡的影响:不同时间点,联合NAC运用蛋白免疫印迹法检测ROS介导的p62积累及其对于DNA损伤修复蛋白（重组蛋白A（RAD51）、肿瘤蛋白p53结合蛋白（53BP1）等）调控的作用;通过特异性小干扰RNA（siRNA）对于p62基因进行沉默,证实p62积累介导对穿心莲内酯诱导的肝癌细胞死亡具有关键性作用。联合p53抑制剂PFT模拟p53突变或缺失的情况后,通过蛋白免疫印迹法,流式细胞术探索p53和p62对DNA损伤修复通路和细胞死亡的作用,进一步证明穿心莲内酯在p53突变或缺失的肝癌细胞中,p62诱导的肝癌细胞死亡仍然发生。结果1.穿心莲内酯能显著抑制肝癌细胞增殖,同时诱导多种肝癌细胞的剂量依赖性和时间依赖性的死亡。细胞死亡具有明显的凋亡特征:首先,在镜下观察可见包括细胞收缩,变小变圆,核染色质浓缩和碎裂等形态学变化;其次,蛋白印迹法显示穿心莲内酯可以剂量依赖性地促进凋亡相关蛋白半胱天蛋白酶（Caspase 3,Caspase 9）的激活以及多聚ADP核糖聚合酶（PARP）的切割。2.穿心莲内酯能明显诱导肝癌细胞活性氧ROS产生,而NAC预处理可以保护穿心莲内酯诱导的肝癌细胞死亡。穿心莲内酯诱导肝癌细胞发生的DNA损伤同样可以被NAC逆转,说明穿心莲内酯引起的DNA损伤依赖于ROS的产生,并为引起肝癌细胞死亡的关键因素。3.肝癌细胞经穿心莲内酯处理后,G2-M期的细胞比例增加,并伴随细胞周期调控蛋白p53以及cyclin B1等蛋白表达上升;通过基因敲除（沉默）或药物抑制细胞周期阻滞和死亡关键蛋白p53功能后,可以抑制周期阻滞的发生;而针对p53下游的DNA损伤修复通路,使用AZD6738（ATR抑制剂）或SCH900776（CHK1抑制剂）预处理后,它同样抑制了穿心莲内酯引起的G2-M周期阻滞。这些结果表明,穿心莲内酯诱导的肝癌细胞G2-M期阻滞依赖于p53的作用。4.当沉默或抑制p53蛋白,或联合使用AZD6738（ATR抑制剂）和SCH900776（CHK1抑制剂）后,加重了穿心莲内酯所导致的肝癌细胞死亡。由于细胞周期阻滞为p53依赖性,肝癌细胞不能通过停滞在G2-M期进行DNA修复作用,从而对肝癌细胞呈现出更快速有效的杀伤作用。以上结果说明,p53依赖的DNA损伤修复通路和细胞周期阻滞对穿心莲内酯诱导的细胞死亡起到了延缓和保护作用。5.经蛋白印迹实验发现,穿心莲内酯可诱导肝癌细胞内p62表达显著上升,并同时伴随p62下游DNA损伤修复蛋白53BP1,RAD51,BRCA1表达下降,而使用siRNA沉默p62基因后可逆转DNA损伤修复蛋白表达的下降行为,并且保护肝癌细胞免于死亡。在p53突变或敲除的情况下,穿心莲内酯介导的p62相关下调DNA损伤修复通路仍然起作用,并且增加药物诱导的细胞死亡情况。这些结果提示穿心莲内酯可以通过ROS诱导的p62的积累,下调DNA损伤修复蛋白,进而消除损伤和修复作用,从而增强对肝癌细胞的杀伤作用。结论我们的研究结果揭示了穿心莲内酯可以通过促进活性氧ROS对肝癌细胞产生杀伤作用;ROS的聚集不仅诱导p62增加;与此同时也促进p53所介导的G2-M期周期阻滞,周期阻滞对肝癌细胞死亡起到修复保护作用;然而p62聚集对DNA修复蛋白的调控作用,逆转了周期阻滞的修复作用,进而增加肝癌细胞对于DNA损伤的反应敏感性。本实验不仅揭示穿心莲内酯杀伤肝癌细胞的分子机制,并提示穿心莲内酯有可能在p53突变型或敲除型肝癌细胞中发挥更有效的抗肝癌作用。这些结果可以为我们对穿心莲内酯抗肝癌及协同治疗提供实验基础和理论依据。