背景和目的目前，银屑病、特应性皮炎(AD)以及白癜风等免疫性皮肤病的发病机制尚不完全清楚，但它们均与免疫炎症有关，特别是皮损处炎症更为显著，这已经成为共识。众多炎症细胞因子和细胞表面抗原分子在这类皮肤病中的参与组成一个庞大的免疫网络，环环相扣，一旦某个或某些环节失衡，就会引起整个免疫网络的紊乱，导致疾病发生，并直接影响病程、病情和临床治疗的选择。我们知道，紫外线(UV)与皮肤息息相关。皮肤中的角质形成细胞(KC)和黑素细胞(MC)是UV照射的重要靶位，临床上采用窄谱中波紫外线治疗上述皮肤病有一定疗效，其作用机制一定程度上与其产生的免疫抑制作用有关。例如，UV照射可减少局部炎症T细胞的浸润；激活抑制性T细胞发挥作用等等。此外，UV照射后皮损处细胞因子和细胞表面抗原表达的改变也使得炎症介质的效应作用减弱。角质形成细胞可分泌多种具有免疫抑制作用的介质，其中，黑素细胞刺激素(α-MSH)的作用不可忽视。α-MSH是近年来的研究热点，它能由多种细胞合成分泌，是一种有效的免疫调节因子，能抑制多种免疫炎症因子的产生和活性；能下调APC共刺激分子B7(CD80、CD86)的表达；能够下调脂多糖或TNF-α诱导的CD54的表达；能抑制脂多糖或IL一1β介导的NF-κB的表达等。表面抗原分子CD40主要表达于抗原递呈细胞，属共刺激分子之一，1985年被认识，1989年被完全克隆，1996、2002年分别被发现能低水平表达于正常人角质形成细胞和黑素细胞，IFN-γ能上调CD40在这两种细胞表面的表达。CD40和它的配体CD40L(CD40L／(gp39))为体内特异性免疫反应系统一对重要的共刺激分子。CD40与gp39相互作用后，能加强KC炎症介质的释放(如IL-8)和其它表面抗原(如CD54)的表达，进一步扩大炎症反应，即所谓的CD40／gp39途径。有关CD40与KC方面的研究内容涉及KC增殖与分化、表皮肿瘤发生、免疫性、炎症性及感染性皮肤病等；而CD40与MC相关的研究内容则较少。由于IFN-γ是体外刺激上调白细胞表面分化抗原最为常用的细胞因子，在人体内也确实发挥了该作用，因此，我们选择它作为实验中细胞表面抗原表达的调节剂。我们的研究目的：①采用不同剂量UVB照射上述两种细胞，评估UVB对细胞作用的时间及剂量效应，以倒置光学显微镜观察细胞受损程度，细胞记数法记录生长曲线，MTT法检测细胞活性，比较人黑素细胞与角质形成细胞对中波紫外线辐射的应激能力，并取适当UVB辐射剂量，为进一步实验提供条件；②中波紫外线辐射对IFN-γ诱导的人角质形成细胞和黑素细胞表面抗原表达的影响，即KC和MC表面能否表达CD40、CD54等分子，其表达能否被IFN-γ上调，UVB照射能否对IFN-γ诱导的KC和MC表面这些抗原分子表达产生影响以及UVB照射对KC和MCα-MSH分泌的时效性影响，探讨UVB影响KC和MC抗原表达的可能机制；③中波紫外线辐射后人角质形成细胞培养液对IFN-γ诱导的黑素细胞表面抗原表达的影响。综上，为临床UVB治疗银屑病、特应性皮炎以及白癜风等免疫性皮肤病提供部分理论依据。方法1．细胞培养：取健康青少年环切术后包皮，经0.5％Dispase液4℃下消化18～20h。眼科镊轻轻分离真表皮，含0.25％胰酶的消化液37℃消化表皮5min，再用含血清的培养基终止消化并离心后，按实验需要加入KC和MC培养基，每3天换液1次，1-2周后即能获得纯培养的角质形成细胞和黑素细胞。将细胞传至2-3代用于实验。2．紫外线照射：将原代黑素细胞与角质形成细胞定量接种于96孔板和直径10cm培养皿中培养。将亚融合状态的培养细胞分为照光组和对照组，用台式UVB照射仪对置于PBS里的细胞进行照射(细胞距紫外光源15cm)。3．光损伤的形态学观察：UVB照射上述2种细胞后，于照射后24h、48h及72h时用倒置光学显微镜(奥林巴斯，CH型)观察各剂量照射组细胞的形态变化。4．细胞计数法记录细胞生长及MTT法检测细胞活性：将细胞于照光后0、24、48、72h分别进行细胞计数和细胞活性检测，并绘制细胞生长曲线。细胞经UVB照射后，每孔加入20μl浓度为5mg／ml的MTT，孵育4h，等量DMSO溶解，酶联免疫检测仪测定各孔在490nm处吸光值(A值)。每组设8个复孔。5．细胞表面抗原的测定：按实验设计相关实验组，加入FITC标记的CD40单抗10μl，重复的两组细胞分别加入CD54和MHC-Ⅱ单抗各10μl，进行流式细胞术测定。加有sCD40L孵育的各组只测CD54和MHC-Ⅱ。6．上清液中α-MSH浓度的测定：采用放射免疫法(RIA)，样本分空白组、300IU／mlIFN-γ组及30mJ／cm~2UVB等3组，分别在0、24、48、72和96h提取上清。检测时，按说明书上步骤进行操作，最后在γ台检测沉淀物的放射活性。7．上清液中IL-6、IL-8、TNF-α浓度的测定：收集各实验组细胞上清液，按照ELIsA说明书严格操作，测定上清液中IL-6、IL-8、TNF-α的含量。8．统计分析：用SPSS11.0统计软件对实验数据进行t检验和方差分析。结果1．UVB照射后，KC的形态学改变、生长曲线及细胞活性的损伤程度随照射剂量加大而加重；MC在较低剂量时无明显受损，但达到一定剂量后其损伤程度亦随照射剂量加大而加重。另经30mJ／cm~2照射孵育24h、48h及72h后，分别对两种细胞进行不同时间段的细胞活性比值比较(72h／48h，72h／24h)，发现KC活性比依次递减(分别为1.81和1.23)；MC的活性比则相反(分别为0.94和1.01)。2．NHK表面能低水平表达CD40等表面抗原，IFN-γ处理后，细胞活性增强，表面抗原的表达显著上调(P＜0.01)；UVB辐射后，细胞活性下降，表面抗原的表达明显下调(P＜0.01)，而上清液中α-MSH的浓度则逐渐上升，照后72h达最高峰(P＜0.01)，变化与表面抗原的表达呈相反趋势。此外，NHK经可溶性CD40配体(sCD40L)配基化后，IL-8的释放和CD54分子的表达得到放大，且表现为CD40特异性，该情况能被sCD40L特异性单抗所阻断。3．MC表面亦能低水平表达CD40，IFN-γ能上调其表达，UVB辐射对表面抗原的表达和上清液中α-MSH的浓度无显著影响。UVB辐射后的人角质形成细胞培养液能下调IFN-γ诱导的黑素细胞表面CD40等抗原分子的表达。结论1．低剂量UVB照射后，KC轻度受损；MC则活性反而增强；较高剂量UVB照射后，MC和KC均有不同程度受损，KC的损伤程度随孵育时间延长而加重，而MC仍可在48h得到恢复。故MC对UVB的应激能力较KC强。2．UVB能显著抑制IFN-γ诱导的NHK CD40等表面抗原的表达，这可能与UVB使NHK自分泌产生a-MSH等免疫抑制物有关；UVB不能直接对MC表面抗原的表达产生影响，但可通过KC分泌α-MSH等免疫抑制物间接抑制IFN-γ诱导的MC表面CD40等抗原分子的表达。CD40参与了众多免疫性皮肤病的发生和发展，UVB是一项干预CD40过表达的有效手段。