脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤之一,国内资料显示,约占所有原发性中枢神经系统肿瘤40-50%。虽然在过去的二十年对胶质瘤生物学和遗传学的了解有了很大提高,但至今仍没有有效方法治愈胶质瘤。目前,脑胶质瘤的治疗手段、主要包括手术治疗;辅助以放射治疗、替莫唑胺化学治疗为首选方案。化疗耐药的存在仍然制约着恶性胶质瘤治疗取得进一步效果。在长征医院神经外科暨上海市神经外科研究所课题组的前期研究中,应用基因芯片技术在生存期长和生存期短的胶质母细胞瘤病人中筛选出一系列表达有差异的基因,应用生物信息学技术进一步分析发现了29个与患者化疗敏感性密切相关的基因,CCND1基因便是其中之一。在其他肿瘤中的研究已表明CCND1表达产物细胞周期蛋白D1的过表达能够增强纤维肉瘤细胞对甲氨蝶呤的耐药性;CCND1蛋白的过度表达能够促进胰腺癌细胞株细胞增殖和抑制化疗药物诱导的凋亡,从而使细胞对化疗耐受。相反,干扰CCND1的表达能够下调多药耐药基因MDR1、MRP1的表达并促进药物诱导的凋亡,从而增强肿瘤细胞对5-FU、顺铂,米托蒽醌以及VP16等化疗药物的敏感性。Sallinen SL等发现CCND1基因表达产物细胞周期蛋白D1的高表达与星形细胞瘤的增殖活性、侵袭力以及病理级别密切相关,是决定星形细胞瘤患者预后的一个重要指标。然而,细胞周期蛋白D1参与星形胶质细胞瘤发生发展过程中的具体机制尚不完全明了,其异常表达是否与星形胶质细胞瘤对化疗药物敏感性相关尚未见报道。本研究通过构建CCND1慢病毒干扰及过表达载体并感染胶质瘤细胞株,建立CCND1不同表达水平的胶质瘤细胞株,研究CCND1在胶质瘤发生发展过程中的可能起到的作用,并进一步探讨CCND1与Temozolomide化疗敏感性的关系。实验共分为三个部分:第一部分,利用CCND1慢病毒干扰及过表达载体感染胶质瘤细胞株,构建CCND1不同表达水平的细胞株;观察其对胶质瘤细胞株增殖、凋亡、侵袭性的影响。第二部分,体外实验观察不同表达水平的CCND1对脑胶质瘤细胞株U87MG、U251MG替莫唑胺化疗敏感性的影响。并观察shRNA联合替莫唑胺作用对U251细胞株克隆形成能力及凋亡的影响。第三部分,构建裸鼠成瘤模型,研究CCND1shRNA联合Temozolomide治疗对裸鼠移植瘤的治疗效果。目的:通过慢病毒载体靶向抑制和过表达CCND1基因,探讨CCND1对胶质母细胞瘤细胞株生长、增殖和凋亡的作用。方法:利用CCND1慢病毒干扰及过表达载体感染SHG-44、U251细胞株,分别抑制和过表达CCND1,构建CCND1干扰及过表达的胶质母细胞瘤细胞系。MTT法测定细胞增殖,流式细胞仪测定细胞周期改变,AV/PI染色测定细胞凋亡,Transwell试验检测侵袭性改变。RT-PCR和Western blot测定CCND1异常表达的细胞株MDR1、MRP1、Bcl-2、Caspase-3、MMP-2、MMP-9等基因mRNA和蛋白表达水平变化。结果:转染CCND1-shRNA可有效降低SHG-44、U251细胞株内的CCND1表达。同对照组相比,干扰CCND1表达后,SHG-44MG、U251MG细胞株增殖受到明显抑制。经流式细胞仪检测,转染CCND1shRNA后SHG-44、U251的凋亡率较对照组明显增加(p<0.01)。侵袭性试验表明CCND1shRNA能够抑制SHG-44细胞的侵袭能力,而过表达CCND1则能够促进SHG-44细胞的侵袭。抑制CCND1表达后,SHG-44细胞内MDR1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9的mRNA表达均较对照组明显降低,而Caspase-3 mRNA表达明显增加,MRP1的mRNA表达无显著变化;而在过表达CCND1的胶质母细胞瘤细胞株,MDR1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9 mRNA表达较对照明显增加,而Caspase-3mRNA表达明显降低,MRP1的mRNA表达无显著变化。在Western blot实验中蛋白表达改变的趋势与上述基因mRNA改变的趋势一致。在U251胶质母细胞瘤细胞株,干扰、过表达CCND1后MDR1、Bcl-2、Caspase-3蛋白变化趋势与SHG-44细胞株中的变化一致。结论:在胶质母细胞瘤细胞株,CCND1干扰使细胞周期停滞在G0/G1期,抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭,并诱导肿瘤细胞的凋亡,下调多药耐药基因MDR1的mRNA及蛋白表达水平。而过表达CCND1可促进肿瘤细胞的侵袭,并抑制肿瘤细胞的凋亡并上调MDR1的表达。因此,CCND1促进肿瘤生长作用机制可能是多方面的,并且其表达可能与肿瘤细胞的耐药相关。方法:利用CCND1慢病毒干扰及过表达载体感染U87、U251细胞株,建立CCND1不同表达水平的U87、U251干扰和过表达的胶质瘤细胞系。上述胶质瘤细胞系与不同浓度Temozolomide共培养三天,MTT法测定第三天细胞抑制率,计算IC50;克隆存活试验检测Temozolomide对U251、U251-shRNA(CCND1干扰稳转株)、U251-GFP(CCND1干扰阴性对照稳转株)克隆形成能力的影响。U251MG、U251-shRNA、U251-GFP与替莫唑胺共培养24 h、48 h、72h、96 h、120 h、144h,流式细胞仪检测不同时间点替莫唑胺对上述三株细胞凋亡的影响,Western blot检测凋亡因子的变化。结果: U87、U87-CCND1-GFP(过表达阴性对照)、U87-CCND1(过表达)、U87-GFP(干扰阴性对照)、U87-shRNA(干扰组)5组CCND1不同表达水平的U87MGIC50值分别为7.13、7.23、21.32、7.01、3.90μg/ml;U251、U251-CCND1-GFP阴性对照、U251-CCND1(过表达)、U251-GFP干扰阴性对照、U251-shRNA(干扰组)5组不同CCND1表达水平的U87MG IC50分别为:9.09、9.35、30.55、8.98、4.76μg/ml。克隆存活试验表明,在不同浓度替莫唑胺作用下U251-shRNA对化疗药物的敏感性明显高于U251。在Temozolomide浓度分别为0、0.05、0.10、0.15μmol/L时共培养72h, U251-shRNA细胞株的克隆存活率分别为0.731±0.08、0.231±0.07、0.097±0.010、0.025±0.003;均显著低于同浓度下U251细胞株的克隆存活率。流式细胞仪检测到在U251MG、U251-GFP细胞,Temozolomide诱导的凋亡率达到50%时出现在药物作用后120小时,而在U251-shRNA细胞株,Temozolomide诱导的凋亡率达到50%时出现在药物作用后72小时。在25、50、100、200μmol/L浓度下Temozolomide共培养96h,U251-shRNA细胞株凋亡率分别为70.62%、80.91%、83.67%.85.09%;相应浓度下U251细胞株的凋亡率分别为41.38%、50.36%、63.54%、67.36%,,U251-shRNA细胞株凋亡率明显高于对照组。结论:CCND1表达水平与U251、U87胶质瘤细胞株对Temozolomide的敏感性存在相关,CCND1shRNA干扰联合Temozolomide能够显著降低U251细胞克隆形成能力并诱导凋亡。CCND1shRNA干扰联合Temozolomide治疗可能为胶质瘤治疗提供一种有效的方法。目的:探讨CCND1干扰及过表达对胶质母细胞瘤细胞系U87MG和U251MG对替莫唑胺化疗药物敏感性的影响。目的:建立U251细胞裸鼠成瘤模型,观察CCND1shRNA对U251细胞株裸小鼠成瘤能力的影响并初步观察CCND1shRNA联合Temozolomide治疗对裸鼠U251细胞移植瘤的影响。方法:随机选取18只裸鼠分3组每组6只,分别皮下接种2X106个U251、U251-GFP、U251-shRNA细胞,观察shRNA对U251成瘤能力的影响。另选取30只裸鼠皮下接种2X106个细胞U251裸鼠。皮下明显成瘤,体积约达到200mm3(长×宽×厚×0.5)时,选取肿瘤大小相近的裸鼠18只,随机分成6组,每组3只裸鼠。分别用PBS、GFP、shRNA、PBS+TMZ、GFP+TMZ、shRNA+TMZ治疗。观察肿瘤体积变化并记录,7天后处死裸鼠,肿瘤组织制成石蜡切片,TUNEL染色分析肿瘤内凋亡。结果:同对照组比较,CCND1shRNA能够抑U251细胞株在裸鼠的成瘤能力。CCND1shRNA、Temozolomide治疗均可诱导裸鼠移植瘤的凋亡,以CCND1shRNA联合治疗对裸鼠肿瘤的抑制最明显。结论:CCND1shRNA联合Temozolomide治疗较CCND1shRNA和Temozolomide单独治疗均能够显著抑制裸鼠U251肿瘤的生长。