玉米作为重要食用和饲用作物,在我国北方地区种植普遍。玉米收获后,产生大量秸秆副产物。目前青贮是这种废弃物利用的主要形式,其过程是在厌氧条件下,利用秸秆表面附生的乳酸菌,转化可溶性碳水化合物,生成以乳酸为主的有机酸,降低饲料的pH值,抑制腐败微生物生长繁殖,从而保持秸秆的营养品质,青贮饲料是反刍动物越冬饲料的重要来源。目前青贮多采用传统方法,即依赖植物表面天然存在微生物的代谢活动,最后形成以乳酸菌为优势菌群的生物质转化过程,鉴于作物种类及其营养成分含量的不同,致使发酵周期长、饲料质量不稳定。因此,在青贮过程中添加青贮剂提高饲料品质逐渐被养殖行业接受。常用细菌接种剂中多选用同型发酵乳酸菌以快速启动发酵,随着接种剂应用的普及,其弊端逐渐暴露,乳酸的大量产生易于引起开窖后的二次发酵,因此异型发酵乳酸菌在青贮中的应用受到重视。此外,为了改善青贮饲料的营养品质和消化利用率,经常在接种剂中复配木质纤维素降解酶。但是外源添加异型发酵乳杆菌以及木质纤维素降解酶或产木质纤维素降解酶的菌株对青贮过程中细菌群落组成的影响及青贮品质的作用研究还很有限。本论文以分析玉米秸秆自然青贮过程中核心微生物动态变化为基础,筛选梳理具有优良特性的乳酸菌以及高产木质纤维素降解酶的菌株,研究它们之间的相互作用及对青贮过程中微生物菌群的影响,为高活性青贮剂的研制提供理论依据。具体成果如下:1.玉米秸秆自然青贮过程中细菌群落的动态变化了解和掌握青贮过程中微生物菌群组成的动态变化,有助于更好的调控青贮发酵过程。乳酸菌对饲料营养品质发挥着重要的作用,是青贮过程中的优势菌群。因此,从青贮饲料中分离鉴定其优势乳酸菌,将其作为青贮饲料接种剂具有很大应用潜力。本文以玉米秸秆为原料,使用2 L青贮罐在实验室条件下进行自然青贮发酵45天,获得的青贮秸秆饲料呈现出优良青贮饲料的特点,如低pH值(3.92±0.02)和高乳酸含量(66.75 ±1.97 g/kg干物质)。使用16S rDNA宏基因组技术对青贮过程中细菌群落变化进行分析,结果显示厚壁菌门、变形菌门和拟杆菌门三者占据了菌群的95%以上。在属水平丰度排序前十的分别为乳杆菌属、肠杆菌属、寡养单胞菌属、假单胞菌属、鞘氨醇杆菌属、泛菌属、鞘氨醇单胞菌属、乳球菌属、沙雷氏菌属和苍白杆菌属。针对其中乳酸菌的分析显示乳酸乳球菌和假肠膜明串珠菌在第3天丰度最高,戊糖片球菌和魏斯氏菌在第6天丰度最高,之后这些产乳酸球菌的丰度迅速降低。而植物乳杆菌群体和短小乳杆菌的丰度先增加后降低,但这两个物种一直以较高水平存在于青贮过程中。香肠乳杆菌和类谷糠乳杆菌的丰度在青贮发酵后期升高。对青贮玉米秸秆及其他来源的秸秆饲料中的乳酸菌进行分离,共获得78株乳酸菌,经16SrRNA基因鉴定将其归类为12种,分别为植物乳杆菌、香肠乳杆菌、嗜酸乳杆菌、噬淀粉乳杆菌、发酵乳杆菌、布氏乳杆菌、短小乳杆菌、类谷糠乳杆菌、口乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌,以及凝结芽孢杆菌。进一步对这些乳酸菌的生长特性进行了研究,获得了一批性能优良的菌株,为研究适用于玉米秸秆青贮的乳酸菌接种剂奠定了基础。2.异型发酵乳酸菌对青贮发酵过程中细菌群落和饲料品质的影响添加同型发酵乳酸菌接种剂能够保证青贮发酵过程的稳定并减少营养成分的损失,但是易于引起青贮饲料的二次发酵。异型发酵乳酸菌的代谢产物乙酸具有很好的抗真菌作用,这使得异型发酵乳酸菌在青贮中的应用受到重视。研究发现我们筛选的异型发酵短小乳杆菌SDMCC050297产酸快,类谷糠乳杆菌SDMCC050300能够将乳酸转化为乙酸和1,2-丙二醇。本文以这两株异型发酵乳酸菌作为接种剂,应用于青贮发酵中,分析它们对玉米秸秆青贮饲料发酵品质以及微生物菌群的影响。结果发现,添加接种剂的实验组中有机酸的积累和pH值的降低更加迅速;青贮发酵20天后,实验组中乳酸含量降低,而乙酸和1,2-丙二醇的含量迅速增加;发酵结束时,实验组和对照组中乳酸/乙酸比值分别为1.27±0.02和3.97 ± 0.2。16S rDNA宏基因组测序分析显示实验组中平均乳杆菌目丰度显著高于对照组。并且在实验组中检测到了高丰度的短小乳杆菌和类谷糠乳杆菌。在第10天时,实验组和对照组中短小乳杆菌的丰度分别为55.74%和5.58%。类谷糠乳杆菌的丰度在20天以后迅速增加,在发酵的第45天时以61.63%的丰度占据青贮饲料菌群,这些结果表明添加的两菌株能够存在于青贮发酵的过程中。除乳杆菌属外,添加的接种剂对其他菌群也有影响。在实验组中,肠杆菌属、假单胞菌属和寡养单胞菌属在青贮前期丰度较高。随着发酵的进行,肠杆菌属和假单胞菌属丰度显著降低,而寡养单胞菌属则降低较少。实验中也监测到一些通常被认为对青贮发酵有害的微生物,例如沙门氏菌、克雷伯菌和假单胞菌,但是这些物种的丰度在实验组较对照组低。以上结果表明,添加短小乳杆菌SDMCC050297和类谷糠乳杆菌SDMCC050300能够在玉米秸秆青贮过程中发挥作用,显著提高饲料中乙酸的含量,并调控发酵过程中其他微生物菌群组成。3.乳酸菌产阿魏酸酯酶对玉米秸秆的水解作用及其分泌特性在构成秸秆成分的半纤维素、半纤维素和木质素之间经常存在酯键将各组分交织成质地坚硬的网状结构,由此阻碍了纤维素酶类对秸秆的降解作用。阿魏酸酯酶能够打开阿魏酸与多糖之间的酯键,在协同纤维素酶和木聚糖酶分解植物细胞壁成分中发挥作用。本文在含有阿魏酸乙酯的平板上,筛选获得了 4株高产阿魏酸酯酶的乳酸菌,分别为噬淀粉乳杆菌CGMCC 11056、嗜酸乳杆菌CCTCC AB2010208、香肠乳杆菌CCTCC AB2016237和发酵乳杆菌CCTCC AB2010204。克隆它们编码的阿魏酸酯酶基因并在大肠杆菌中进行了异源表达。序列分析显示它们的相似性在45-85%之间,对模式底物(阿魏酸甲酯、咖啡酸甲酯、香豆酸甲酯和芥子酸甲酯)的降解表明它们均属于C型阿魏酸酯酶。它们能水解玉米秸秆释放出酚酸,其中以噬淀粉乳杆菌CGMCC 11056的阿魏酸酯酶降解效率最高,达80 μM。在含有模式底物的培养基中生长时,这四株乳杆菌不仅可以降解酚酸酯,还具有代谢酚酸的能力,预示它们在青贮中对秸秆中的酯键具有一定的降解能力。根据SignalP4.0预测结果,这些阿魏酸酯酶均没有信号肽序列,但在平板上产生水解圈,显示出胞外酶的特性,因此对阿魏酸酯酶分泌机制进行了研究。首先构建了可以在植物乳杆菌和大肠杆菌中复制的穿梭表达载体pLP3804。将噬淀粉乳杆菌CGMCC 11056的阿魏酸酯酶连接载体转化后,发现在植物乳杆菌CGMCC 6888和大肠杆菌DH5α的胞外均可以检测到阿魏酸酯酶的存在。利用点突变将阿魏酸酯酶106位的丝氨酸突变为丙氨酸,构建酶的失活突变体,结果仍然在植物乳杆菌CGMCC 6888和大肠杆菌DH5α的胞外检测到蛋白,表明阿魏酸酯酶的分泌不是由于其活性降解细胞膜所引起的泄漏。进一步将阿魏酸酯酶N端20个氨基酸缺失后,只能检测到它存在于胞内,表明N端序列在酶的分泌中发挥作用。此外,阿魏酸酯酶及其N端序列均可以将外源蛋白转运至植物乳杆菌和大肠杆菌的胞外。这是关于非典型信号肽序列在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中转运蛋白的首次报道。4.产木质纤维素降解酶菌株对乳酸菌的促生长作用玉米秸秆主要由纤维素、半纤维素、木质素以及很少的可溶性碳水化合物组成。而且,乳酸菌缺乏能够将木质纤维素成分降解为可溶性碳水化合物的酶类,这极大地限制了乳酸菌在青贮发酵过程中的生长。乳酸菌和木质纤维素生物质降解菌广泛存在于植物表面。在青贮的过程中,这些微生物共同作用对作物进行发酵。本文以筛选的一株产内切葡聚糖酶和内切木聚糖酶的人参土地类芽孢杆菌SDMCC050309为例,研究木质纤维素降解酶产生菌对乳酸菌接种剂的作用。酶谱分析显示菌株SDMCC050309分别产生四条内切葡聚糖酶活性蛋白和七条内切木聚糖酶活性蛋白,分子量介于18到100 kDa之间。利用微晶纤维素吸附,结合质谱鉴定,获得了两个内切纤维素酶Ce15和Ce19。它们都能够降解羧甲基纤维素生成纤维寡糖,纤维寡糖对同型发酵接种剂植物乳杆菌CGMCC 6888和香肠乳杆菌CCTCCAB2016237的生长有促进作用,并产生乳酸。通过序列相似性比对方法克隆了内切木聚糖酶Xyn10和Xyn1 1,它们可以高效地降解桦木木聚糖以及碱预处理的玉米秸秆生成木寡糖。产生的木寡糖能够促进异型发酵接种剂短小乳杆菌SDMCC050297和类谷糠乳杆菌SDMCC050300的生长,并且这些菌株可以利用木寡糖产生更多的乙酸。这些结果有助于更好的理解青贮过程中产木质纤维素降解酶微生物与乳酸菌的相互关系,以及纤维素酶和木聚糖酶对不同发酵类型乳酸菌的促生长作用。5.复合接种剂在玉米秸秆青贮和黄贮中应用效果评价以植物乳杆菌CGMCC6888、香肠乳杆菌CCTCCAB2016237、短小乳杆菌SDMCC050297、类谷糠乳杆菌SDMCC050300和人参土地类芽孢杆菌SDMCC050309复合成接种剂,研究添加接种剂对玉米秸秆青贮饲料的应用效果,并与其它商业化青贮剂进行比较分析。实验结果显示添加接种剂后,饲料pH值下降的更低(对照组vs实验组,3.75 ±0.07 vs 3.64 ±0.02),乳酸菌数量(对照组 vs 实验组,2.02±0.93×1010vs9.77±6.81×1010cfu/kg)和乳酸含量(对照组 vs实验组,42.31 ± 1.79 vs 53.27± 3.77 g/kg)也明显提高。并且相较于其它青贮剂,我们的复合接种剂在降低饲料pH值、减少干物质损失、抑制腐败菌的生长、提高乳酸菌数量和有机酸含量各方面也都具有优势。这些结果表明我们的复合接种剂能够明显提高青贮饲料发酵品质,具有应用潜力。与青贮使用新鲜秸秆不同,黄贮是利用干秸秆做原料,其中可溶性碳水化合物(11.3g/kg)和乳酸菌(2.1×107cfu/kg)含量均较少。黄贮实验结果表明,黄贮过程严格依赖于接种剂,添加接种剂发酵后,秸秆呈亮黄色、味酸甜;不添加接种剂秸秆发黑、腐臭味。同时接种剂和酶制剂的混合使用才能够获得高品质的发酵饲料。发酵14天时,实验组中还原糖、乳酸菌数量和乳酸含量分别为7.1 g/kg、3.3×1010cfu/kg和40.83g/kg。这些结果表明接种剂能够补充干秸秆附着乳酸菌的不足,而酶制剂可以分解木质纤维素生物质成可溶性碳水化物,促进乳酸菌在饲料中的生长。我们进一步探究了不同酶制剂对黄贮饲料中有机酸组成的不同作用,结果显示添加纤维素酶和木聚糖酶的饲料中乳酸/乙酸分别为2.53±0.16和1.49±0.13。以上这些结果为在我国北方推广使用本青贮剂奠定了理论和实践基础。