百合无症病毒的RT-PCR和核酸杂交检测及其外壳蛋白在大肠杆菌中的表达

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百合无症病毒是危害百合的重要病毒,在世界各地均有分布,是我国禁止进境的潜在危险性有害植物病毒。该病毒病的发生日益严重,给百合种植业造成极大的经济损失。目前我国植物病毒检验检疫工作和脱毒检测的大量应用还是在血清学检测上,特别是ELISA 检测。但百合无症病毒难以提纯作为抗原,抗血清的生产没有完全达到商品化,检测基本依赖外国进口试剂盒。分子生物学检测方法灵敏度高,有很高的实际应用价值。为此,本研究开展百合无症病毒的分子生物学检测方法及外壳蛋白原核表达的研究,为其检验检疫提供方法标准,并为抗血清的制备提供蛋白融合表达抗原材料。 对百合病株检测表明,直接法,间接法,双抗夹心法,斑点酶联四种血清学检测限度依次为:灵敏度320μg, 160μg, 80μg, 160μg 病叶。植株脱毒苗的检出率分别为30%,35%,45%,55%。 根据百合无症病毒核酸序列设计一对特异性引物,对提取百合叶片中总RNA 进行反转录扩增,得到412 bp 的目的片段,建立百合无症病毒的RT-PCR 检测方法。将此片段克隆到pUCm-T 载体上,酶切后回收目的片段。用随机引物法地高辛标记合成cDNA探针,进行核酸斑点杂交检测。RT-PCR 和核酸杂交检测百合病叶总RNA 的稀释限度分别为1:10-6和1:10-2。检测方法快速,灵敏。 应用RT-PCR 方法从感病百合总RNA 中扩增出百合无症病毒的外壳蛋白基因片段,连接到原核载体pUC19,转化大肠杆菌DH5α并用IPTG 诱导表达。SDS-PAGE 及Western blot 分析表明:外壳蛋白基因在大肠杆菌中获得了特异性表达,融合蛋白分子量约为35kD。 重点讨论了各种检测方法在实际中的应用,百合无症病毒提取过程中需要解决的问题,外壳蛋白基因在大肠杆菌中表达载体的构建。 研究结果建立了检测百合无症病毒的RT-PCR 和核酸杂交检验检疫标准,构成了百合无症病毒的检测体系,得到表达外壳蛋白基因的大肠杆菌菌株,为其抗血清的制备打下了基础。
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