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羽毛是畜禽养殖业的主要副产物之一,蛋白含量达90%以上,是一种优质动物蛋白源,可用来开发多种产品或从中提取生物活性肽;但目前只有少量被加工成羽毛粉用作动物饲料添加剂,大多直接被丢弃,造成极大的浪费。如何充分利用废弃羽毛资源,提高其经济效益,具有十分重要的意义。 寡肽通常是指由2-20个氨基酸残基组成,分子量分布在2000Da以下的短肽,由于寡肽不仅具有良好的营养特性,通常还具有多种生理活性,如抗氧化性、抗菌性、提高免疫力等。因此,利用生物学效价不高的工农业废弃物生产寡肽成为研究热点。本研究旨在以寡肽产率为指标,筛选高效降解羽毛产寡肽菌株,研究其降解羽毛产寡肽特性、羽毛寡肽的特征以及发酵液的生物活性。以期为微生物发酵法制备羽毛寡肽提供科学依据,实现废弃羽毛资源的高效、增值利用奠定基础。主要内容如下: (1)从羽毛堆积物及其土壤、鸡粪堆肥土壤、养鸡场的下水沟淤泥和发酵池沼渣中分离筛选到16株羽毛降解菌,将其置于以羽毛为唯一碳氮源的发酵培养基中,37℃,150r/min培养48h后,通过产寡肽效果评价,从中挑选出3株高产寡肽优势菌株H0、H5、H11;该3株菌的羽毛降解率分别为61.36%、59.17%、73.22%,寡肽产率分别为16.33%、19.17%、19.92%。根据形态学、生理学特征以及16S rRNA分析,初步鉴定这3株菌分别为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和耳炎假单胞菌(Pseudomonas otitidis)。 (2)分别取培养8h、10h、10h的H0、H5、H11菌液作为种子液,按2%接种量接种于发酵培养基中,考察菌株降解羽毛产寡肽的最适发酵条件。结果显示:菌株H0、H5、H11最佳发酵初始pH值分别为11.0、9.0、11.0;最佳发酵温度均为40℃。在各自最佳培养条件下,测得菌株H0、H5、H11的最大羽毛降解率分别为90.67%、87.88%、92.07%;最大寡肽产率分别为38.19%、25.23%、35.37%(分别占可溶性总肽的67.52%、55.49%、69.71%)。比二次复筛所测寡肽产率分别提高了133.86%、31.61%、77.56%,发酵产物的体外消化率分别达到82.64%、76.12%、82.37%,优于水解羽毛粉、羽毛蛋白粉和鱼粉。 (3)液质联用(LC-MS/MS)分析结果表明,3株菌所产羽毛寡肽的分子量主要分布在1600Da以下,富含支链氨基酸,且主要是由5-10个氨基酸组成的短肽。此外,3株菌的发酵液均检测到17种游离氨基酸(包括缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、赖氨酸等多种必须氨基酸)。 (4)通过DPPH自由基清除能力、超氧自由基清除能力和还原能力的测定,对羽毛发酵液的抗氧化性进行评价。结果显示,3株菌的羽毛降解液均具有一定的抗氧化能力。菌株H11发酵液的DPPH自由基清除能力、超氧自由基清除能力较强,其EC50值分别为0.97mg/ml、4.24mg/ml;H0次之,分别为3.06mg/ml、5.63mg/ml;H5分别为3.81mg/ml、5.67mg/ml。还原能力大小为H11>H0>H5。在一定浓度范围内,发酵液抗氧化性随浓度增加而增强。 (5)将羽毛发酵液离心后分别经5000Da、2000Da超滤膜过滤,收集滤液,冻干成粉,得到组分UF0(发酵原液)、UF1(<5000Da)、UF2(<2000Da)。对3种组分的自由基清除活性进行比较,结果表明H11发酵液中各组分的DPPH自由基清除能力和超氧自由基清除能力为:UF0>UF1>UF2;H0和H5发酵液的DPPH自由基清除能力和超氧自由基清除能力均为:UF0>UF1,说明羽毛发酵液中发挥抗氧化作用的主要是分子量在5000Da以上的多肽。