骨缺损和骨折延迟愈合不愈合一直是困扰骨科临床工作的一项难题，每年有数百万的骨缺损和骨折延迟愈合不愈合病例寻求临床治疗。通常，我们仍然应用传统的自体骨、异体骨和人工替代材料的方法解决这个临床难题。但是，自体骨来源有限并造成额外创伤，异体骨有传染疾病和存在免疫排异的潜在危险，人工替代材料在生物相容性、力学性能等方面尚存在诸多问题。自1990年起，大量的研究报告显示，骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein，BMP)具有促进骨缺损修复和异位成骨的作用。骨形态发生蛋白属于转化生长因子-β超家族成员。其中，骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)是骨形态发生蛋白家族中唯一能单独异位成骨和单独促进骨缺损愈合修复的骨生长刺激因子。大量研究表明其在骨科临床上用来促进骨折愈合，进行关节间融合和防止人工假体松动等方面有良好的应用前景。但是，单靠外源性植入往往不能满足骨损伤修复的需要，而且目前尚缺乏理想的载体。基因治疗作为一种新的治疗方法，与植入基因工程重组的BMP相比，理论上讲具有能够进行BMP持续的释放、避免植入载体等多方面的优点。 骨髓基质干细胞(MSCs)因其来源广泛易于获取可以成为基因治疗研究中很好的细胞载体。作为一种具有多向分化能力的前体细胞，骨髓基质干细胞(MSCs)几乎可以从鸡、鼠、兔、羊和人类的所有骨髓中提取分离出，而且，不同于造血干细胞，体外的培养扩增也相对容易。人类骨髓基质干细胞(MSCs)可以在体外的培养15代而不丧失其分化潜能第四军医大学博士学位论文和生物学特性t201。人们已经熟知骨髓基质干细胞(MsCs)具有良好的向骨、软骨、肌键、肌肉和脂肪细胞转化的潜能，这更使它成为骨组织工程种子细胞研究中的首选。 己有较多用逆转录病毒、腺病毒、质粒技术将骨形态发生蛋白(B MP)转染Mscs，局部基因治疗促进骨缺损愈合的研究报道12”261。一般认为，相对于逆转录病毒18一65%125，261，腺病毒20%的转染率[24]，质粒转染的效率较低为11%[241。但由于非病毒质粒易于制备，安全无毒，易形成规模生产，我们的实验选择非病毒的质粒介导骨形态发生蛋白一2(BMP一2)转染骨髓基质干细胞(MSCS)，研究其转染后外源基因表达情况及对骨髓基质干细胞(MSCs)成骨特性的影响，并以新西兰白兔为动物模型，研究其在活体内的成骨效应。骨髓基质干细胞(MSCs)中包括了诱导性骨祖细胞(roPC)和确定性骨祖细胞(DOPC)，后者无需诱导因子的作用本身就具备了成骨分化的能力，而前者在骨形态发生蛋白一2(bone mo印hogenetie protein一2，BMP一2)等成骨刺激因子作用下也向成骨分化[27 .30]。利用脂酷体介导的基因转染技术，将人BMP一2基因导入骨髓基质干细胞(MSCs)，使骨髓基质干细胞(MSCs)在发挥基因治疗的细胞载体的同时，利用自体分泌的活性BMP一2蛋白促进其向成骨细胞系的分化是我们实验的设计思想之一。在对人和兔骨髓基质干细胞(MSCs)体外培养扩增的过程中，我们也着重观察了不同年龄供体的骨髓基质干细胞的生长特性，为今后进一步进行以骨髓基质干细胞作为细胞载体的基因治疗研究打下基础。实验一构建真核细胞表达载体PcDNA3一hBMPZ[目的]:为了研究人类骨形态发生蛋白一2(bone mo印hogenetie protein一2，BMP一2)转染骨髓基质千细胞(MSCs)的稳定表达以及对转染后骨髓基质干细胞(MSCs)生物学特性的影响，为了进一步研究非病毒载体介导的BMP一2转染MSCs在动物体内成骨修复的作用，构建真核表达载体PcDNA3一hBMPZ。〔方法l:本实验应用基因重组技术将人类全长BMPZcDNA定向克隆到真核表达载体PcDNA3内，形成重组真核表达载体peDNA3一hBMPZO peDNA3质粒是一种由CMv为起动子的真核表达载体，第四军医大学博士学位论文除CMV作为其启动子外，在其多接头位点前还附加一高效增强子SV40，后者是能促进基因转录活性的顺式调控元件。我们用Hind川和Xbal双酶切含有人类骨形态发生蛋白一2全长cDNA的pGEM一3一hBMPZ，回收hBMPZ基因片段，将其连入经Hind川和Xbal双酶切后的真核表达载体PcDNA3，构建重组真核表达载体PcDNA3一hBMPZ。重组的真核表达载体peDNA3一hBMPZ经Hind 111和Xbal双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。[结果〕:双酶切后可形成两条带，分子量分别为1.3kb和5.38kb，符合物理图谱。[结论]:真核细胞表达载体PcDNA3一hBMPZ构建成功。实验二人骨髓基质细胞的获取、体外培养及生物学特性的观察[目的]:体外培养了不同年龄段的人骨髓基质细胞(hMsCs)，对其不同的生物学特性进行观察，为进一步了解人骨髓基质细胞作为基因转载和表达的细胞载体和可作为外源性组织细胞的可行性奠定基础。防法]:取年龄分别为4岁、38岁和58岁的三名志愿者的骼骨骨髓，以20 ml PBS混合并剪碎，以Percon氏液梯度离心，吸取中间白色的单核细胞层其中包含人骨髓基质细胞，用含100，0胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素的DMEM全培养基37℃，5%COZ饱和度条件下培养，适时换液处理，清除未贴壁的血细胞，保留贴壁的骨髓基质细胞扩增培养，倒置显微镜下每